H1亚型流感病毒通用疫苗的构建及其对小鼠免疫保护效力研究

本研究旨在为研制一种安全、有效并具有广泛保护作用的流感病毒通用疫苗进行初步的探索。从Gen-Bank上获得所有H1亚型经典猪源流感病毒和甲型流感病毒的HA基因序列,通过系统进化分析获得其共有序列,并对共有序列进行密码子优化(Optimized consensus,opti-CS),同时将H1亚型的A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和重组甲型流感病毒rPan09(H1N1,其HA和NA来自A/Swine/California/04/09,其余6个片段来自PR8的重组病毒)的HA基因分别进行密码子优化(opti-G11,opti-r09),并将这3种片段与真核表达载体pCAGGS连接获得重组质粒pCA-opti-CS、pCA-opti-G11和pCA-opti-r09。将重组质粒瞬时转染293T细胞,检测HA基因在哺乳动物细胞中的表达情况。免疫6～8周雌性BALB/c小鼠,免疫3次,每次间隔3周,同时设立空载体pCAGGS对照。三免2周后从每个质粒免疫组中选取一半小鼠每只以50μL 103.87 EID50的剂量接种A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)病毒,另一半小鼠每只以50μL 107.45 EID50的剂量接种rPan09病毒。采集血清,对HA抗体水平、HI滴度、细胞因子产生情况、肺组织病毒含量进行检测,并对肺组织病理学变化进行观察。结果显示:重组质粒中HA基因均能够在哺乳动物细胞中有效的表达。pCA-opti-CS免疫后能够诱导小鼠产生较高的HA抗体水平,较高的HI滴度,并且能够诱导机体产生较高水平的IL-4和IFN-γ。肺组织病毒含量测定以及组织病理学观察结果显示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS免疫后能够有效限制病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和rPan09HA在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。结果提示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,并具有较好的交叉保护效力,能够保护小鼠抵抗异源流感病毒的攻击。本研究为流感通用疫苗的研究提供了有益的参考。     

H1亚型猪流感病毒HA基因密码子优化的DNA疫苗免疫保护效力研究

DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量及表达抗原的免疫原性有直接关系。为了提高猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）HA基因DNA疫苗的表达量,增强其免疫效果,本研究通过人工合成的方法将H1亚型猪流感病毒A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）的HA基因密码子优化为猪体内偏嗜性密码子optiHA,同野生型A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）的HA基因分别与真核表达载体PCAGGS连接构成重组质粒PCAGGS—optiHA和PCAGGS—HA,然后分别转染293T细胞,48h后采用间接免疫荧光的方法检测Ⅲ基因的瞬时表达蛋白情况。将质粒PCAGGS—HA、PCAGGS—optiHA以100μg／只的剂量,采用后腿肌肉多点注射的方式,免疫6-8周龄雌性BALB／c小鼠,同时设立空载体PCAGGS对照。共免疫3次,每次间隔2周,三免2周后对每组以10^3.87 EID50的A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）进行攻毒。采用ELISA、血凝抑制试验、细胞因子检测和肺组织病毒含量测定等实验评价这两种DNA疫苗的免疫效果。结果表明,HA基因密码子优化的DNA疫苗可显著提高体液免疫和细胞免疫的应答水平,攻毒后免疫组PCAGGS—optiHA的保护效力明显高于免疫组PCAGGS—HA。这一结果为进一步研究和设计有效的SIVDNA疫苗奠定了基础。     

抗猪甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备与特性分析

本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体.采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293T细胞中得到表达.将pCAGGS-HA以100 μg·只-1剂量免疫5周龄BALB/c小鼠,获得4株稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为11G7、3C10、3G3和2B11.其中11G7诱导小鼠产生的腹水HI效价为14log2,中和效价为1:8 192,HI试验结果进一步表明11G7只与甲型H1N1流感病毒发生反应,而不与其他H1N1、H1N2、H3N2、H5N1及H9N2亚型流感病毒反应.该MAb的制备将为建立猪甲型H1N1流感病毒与传统亚型SIV的鉴别诊断方法奠定基础.     

Clade 2.3.2e H5亚型禽流感DNA疫苗的免疫保护效力研究

为研制和更新针对H5亚型禽流感病毒(AIV)流行株的DNA疫苗,本研究将新近分离的H5亚型AIV Clade2.3.2e分支代表株A/Duck/Anhui/S1246/2015 (DK/AH/S1246/15)密码子优化的HA基因定向克隆至载体pCAGGS中构建重组质粒pCA-S1246,将该质粒转染293T细胞。利用间接免疫荧光和western blot检测,结果显示, HA蛋白可以在293T细胞中正确表达。将15μg、 30μg和60μg的p CA-S1246质粒分别免疫3周龄的SPF鸡, 3周以后以相同的剂量加强免疫后1周,检测其HI抗体平均效价分别可达1∶56、 1∶16和1∶37;加强免疫1周后用105EID50的DK/AH/S1246/15进行攻击时,免疫组的保护率为100%。本研究为DNA质粒pCA-S1246作为防控Clade.2.3.2e AIV的候选DNA疫苗株提供了实验依据。     

重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒疫苗株的构建及免疫保护效力

以国内欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒流行株A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1)(SH1)为材料,RT-PCR扩增HA和NA基因并将其克隆至PBD载体中,构建HA和NA基因的重组质粒。将HA和NA基因重组质粒及来源于流感病毒高产株PR8的6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)重组质粒共转染293T细胞,从而成功构建了重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒疫苗株SH/PR8。以相同病毒剂量接种MDCK细胞,检测不同时间点的血凝效价,绘制病毒生长曲线,结果表明,重组病毒SH/PR8相对于原始野生株SH1在MDCK细胞上具有更高的病毒滴度。重组病毒SH/PR8制备的灭活疫苗经过一免和二免小鼠后,检测血清中血凝抑制抗体、中和抗体和IgG抗体,结果显示首免后抗体效价持续升高,4周后抗体效价达到峰值。小鼠攻毒试验结果表明,免疫组体质量下降不明显且未出现死亡,而非免疫组小鼠体质量持续下降并且于攻毒后6d小鼠出现100%死亡。肺脏组织病毒含量滴定以及组织病理学观察结果显示,免疫组能够有效抑制SH1病毒在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。总之,本研究表明重组SH/PR8疫苗候选株相对于原始毒株SH1在MDCK细胞上具有更高的复制能力,制备的重组灭活疫苗能够诱导机体产生高水平的抗体,能够针对欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒的攻击提供很好的免疫保护。     

表达H1N1、H3N2猪流感病毒HA基因重组质粒在小鼠的免疫效力

应用已构建的真核表达质粒pCI-H1-HA、pCAGGS-H1-HA、pCI-H3-HA和pCAGGS-H3-HA作为DNA疫苗，利用BALB／c小鼠进行免疫保护试验，通过测定不同免疫期HI抗体滴度、分析攻毒后BALB／c小鼠体重变化及肺脏病毒含量，评价DNA疫苗的免疫效力。结果表明：构建的DNA疫苗均可诱导小鼠产生免疫力；BALB／c小鼠体重变化统计学分析显示，免疫组与对照组差异极显著（P〈0．01），pCAGGS表达载体构建的DNA疫苗免疫效果优于pCI表达载体构建的DNA疫苗（P〈0．05）。     

H9亚型禽流感病毒血凝素特异性单因子血清制备

为制备特异性的H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清,本研究分别将6株不同亚群的H9亚型AIV的血凝素(HA)基因以鸡偏嗜的密码子进行优化,经全基因合成插入高效真核表达载体pCAGGS中,构建的真核重组质粒转染293T细胞进行瞬时表达,间接免疫荧光试验结果表明,重组质粒中的HA目的基因获得表达.将重组质粒以200μg/只的剂量免疫1月龄SPF鸡,6周后采血分离血清.交叉微量血凝抑制试验结果表明,血凝抑制效价可达8 long2～12 log2,灵敏度高,与其他AIV亚型抗原无交叉反应,型特异性强.     

鸭坦布苏病毒E基因DNA疫苗构建及免疫原性的初步研究

鸭坦布苏病毒(DTMUV)感染引起产蛋鸭产蛋急剧下降.目前,没有预防该病的疫苗.为研究DTMUV DNA疫苗的免疫效果,本研究将DTMUV的E基因插入pCAGGS载体,构建了重组质粒pCAGGS-E.将pCAGGS-E转染293T细胞后,采用间接免疫荧光(IFA)和western blot检测E蛋白的表达情况.结果显示,两种方法均检测到了E蛋白的特异性表达.将pCAGGS-E用脂质体包裹后通过尾静脉注射免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测抗体的产生情况.结果表明,随着免疫次数的增加及免疫时间的延长,免疫小鼠的抗体滴度逐渐升高.本研究证明,编码E基因的重组质粒DNA免疫小鼠后能够诱导有效的免疫应答,为DTMUV DNA疫苗的研究奠定了基础.     

含有鸡体偏嗜性密码子的H5亚型禽流感病毒HA基因的优化构建及其DNA疫苗体外瞬时表达研究

不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒的密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的表达A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA蛋白的基因optiHA5,并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIoptiHA5,将含有GD/1/96(H5N1)野生型HA基因的质粒pCIHA5和pCIoptiHA5分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24～48h293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白;Westemblot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果表明密码子优化的基因optiHA5体外瞬时表达水平显著高于野生型HA基因.这一结果为进一步开展SPF鸡免疫保护效果的比较研究奠定了基础.     

表达H5亚型禽流感同义(Consensus)HA蛋白的重组质粒构建及体外表达

为研究禽流感病毒(AIV)H5亚型同义Consensus HA(Cons-HA5)基因的重组表达质粒在体外的表达情况,本研究通过对从NCBI流感数据库中获得的5000条H5亚型AIV的HA蛋白的序列比对、分析获得一条同义HA蛋白,将其相对应的核苷酸序列进行鸡体偏嗜性密码子优化,人工合成Cons-HA5基因并克隆于真核表达载体pCAGGS中构建重组表达质粒pCACons-HA5。将重组质粒转染293-T细胞,在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间HA蛋白的表达情况,同时在转染后24 h、48 h后分别进行表达蛋白的western blot检测。结果表明,pCACons-HA5转染293-T细胞后,其表达的HA蛋白先分布于细胞质中,而后转移至细胞膜表面;westernblot鉴定结果表明,Cons-HA5重组蛋白可以与AIV多克隆血清反应分子量约为70 ku。该重组质粒的构建将为进一步Cons-HA5核酸免疫对H5亚型不同抗原群AIV的交叉保护免疫效力研究奠定基础。     

Prime-boost immunization with HA/C3d DNA followed by a recombinant pseudorabies virus boost enhanced protective immunity against H3N2 swine influenza virus in mice

DNA and recombinant virus vaccines against swine influenza virus (SIV) have been pursued with promising results, but induce poor immunogenicity. This study evaluated the effects of a vaccine regimen in mice including priming with three DNA vaccines expressing soluble HA (sHA), complete HA (tmHA), or sHA fused with three copies murine C3d (sHA-mC3d3) and boosting with recombinant pseudorabies virus expressing HA (rPRV-HA). Immune responses were monitored by ELISA, HI assays, and virus neutralization. Protective efficacy was evaluated by virus isolation from lungs, distribution in tissues, and pathology following challenge with H3N2 SIV. Priming with sHA-mC3d3 and boosting with rPRV-HA induced higher levels of HA-specific antibodies and yielded the most effective protection. This finding implied that priming with a DNA vaccine expressing C3d fused with antigen and boosting with a recombinant vector vaccine is an effective way to induce protective humoral immunity and prevent some infectious diseases.     

马流感病毒血凝素基因甲病毒复制子重组表达质粒的构建及其免疫效力评价

为评价马流感病毒(EIV)HA基因核酸免疫效果,本研究以甲病毒复制子载体pSFV1CS分别构建了表达EIV H3N8亚型的美洲型和欧洲型HA基因的重组真核表达质粒。并将其转染293T细胞,经间接免疫荧光鉴定表明HA基因获得表达;以重组质粒免疫的BALB/c鼠能够检测到特异性抗体产生,而且HI抗体水平持续升高,同时小鼠体内IFN-γ、IL-4分泌水平也有所升高。攻毒后小鼠表现轻度临床症状,但病毒分离和RT-PCR均未检测到病毒。上述结果表明,该重组质粒pSFV1CS-EIV-HA具有良好的免疫原性并且可以诱导免疫动物产生较高免疫应答的能力。     

猪伪狂犬病病毒gD核酸疫苗构建及IL-15基因佐剂对其免疫增强试验

运用PCR技术扩增出伪狂犬病病毒糖蛋白gD基因,将该基因定向克隆于真核表达载体pcDNA3.1+、pCI-neo中,命名重组质粒为pcD-gD、pCI-gD.以小鼠为动物模型,对构建的基因疫苗进行免疫原性的初步评价.为了证明细胞因子是否能增强基因疫苗的免疫效力,本试验用IL-15的表达质粒联合pcD-gD、pCI-gD免疫.结果表明,重组质粒组主要提高细胞免疫水平,特别是联合组中的CD8~+相对其他组别较高.重组质粒在体液免疫方面没有表现出优势,抗体滴度达不到阳性对照组的水平,但是整个抗体水平相对稳定,提示DNA疫苗诱导的抗体维持时间较长.     

禽流感病毒A/duck/Fujian/31/2007(H5N1)株M1 基质蛋白的原核表达与免疫原性鉴定

经生物学软件DNAStar分析,参照已发表的禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)(H5N1)基因组序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约750 bp的M1基因片段,将目的片段定向克隆至pET30a表达载体,经酶切及测序鉴定正确后转化BL21表达菌,经IPTG诱导获得以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,BCA法测定纯化蛋白的浓度为0.656 mg/mL,免疫印迹检测结果表明,纯化的重组蛋白具有良好的反应活性。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测结果表明,重组蛋白可产生抗M1蛋白特异性抗体,具有良好的免疫原性。本研究成功表达了流感病毒H5N1的基质蛋白M1,且重组蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研制H5N1亚型流感病毒诊断试剂及基因工程疫苗奠定基础。     

A recombinant pseudorabies virus encoding the HA gene from H3N2 subtype swine influenza virus protects mice from virulent challenge

The hemagglutinin (HA) gene of A/Swine/Inner Mogolian/547/2001 (H3N2) swine influenza virus (SIV) was recombined into the genome of pseudorabies virus (PRV) Bartha-K61 vaccine strain, generating a recombinant PRV expressing the HA gene, designated as rPRV-HA. One group of 15 mice was inoculated intranasally (i.n.) with 10(5.0) PFU of rPRV-HA, and another two control groups of mice (15 mice per group) were mock-inoculated or inoculated with Bartha-K61. Mice inoculated with rPRV-HA developed hemagglutination inhibition antibodies 3 weeks post-inoculation. Twenty-eight days post-inoculation, all mice were challenged i.n. with 10(5.0) TCID50 of A/Swine/Heilongjiang/74/2000 (H3N2). No challenge virus was isolated from vaccinated mice, and mild pathological lesions were observed only in lungs following challenge. The results demonstrate that the recombinant rPRV-HA expressing the HA gene from H3N2 SIV can protect mice from heterologous virulent challenge, and may represent a candidate vaccine against SIV.