柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。     

日本血吸虫7d童虫cDNA文库构建及免疫筛选

为了从7 d童虫cDNA文库筛选出童虫发育阶段特异性表达抗原基因。本研究首先构建了日本血吸虫7 d童虫cDNA文库,其次再采用日本吸血虫感染血清进行筛选。结果显示:建立的文库插入片段为0.5~3.0 kb,文库重组率为98%,初始文库滴度为2.4×10~6 pfu/mL,扩增后滴度为1.6×10~9 pfu/mL,利用感染日本血吸虫10 d和42 d的小鼠血清免疫筛选该文库,初筛和复筛后获得17条有效EST序列,其编码7个基因,分别为复制蛋白(2 ESTs)、肝再生增强因子(3 ESTs)、血小板活化因子(6 ESTs)、钙调理蛋白基因(3 EST)、丝束蛋白(1 ESTs)、核糖体RNA(1 EST)和还原型辅酶脱氢酶基因(1 EST)。该研究结果对今后探讨血吸虫的生长发育机制及筛选血吸虫早期诊断抗原具有重要意义。     

鸭胚成纤维细胞T7噬菌体文库的构建

本实验旨在构建鸭胚成纤维细胞T7噬菌体cDNA文库.通过分子生物学方法,将鸭胚成纤维细胞cDNA片段连接于T7SeLect 10-1载体上,然后进行体外包装、原始文库的测定、扩增及滴度的测定、序列测定.实验结果显示,构建的原始cDNA文库的滴度为1.2×106pfu/ml,扩增后文库滴度为2.1×1011pfu/ml,重组率为63％,片段大小主要集中在0.25～0.75 kb之间,测序结果显示10个克隆中有7个克隆插入序列与鸭的基因序列同源,其余3个序列为空载体.本实验成功的构建了鸭胚成纤维细胞T7噬菌体文库,为进一步研究鸭胚成纤维细胞蛋白相互作用提供了实验研究平台.     

蜜蜂球囊菌全长cDNA文库的构建与分析

本试验利用TRIzol试剂盒提取蜜蜂球囊菌总RNA,通过Oligotex纯化试剂盒将mRNA反转录成cDNA,再以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA,该cDNA产物经分级分离和体外包装,即获得蜜蜂球囊菌cDNA原始文库,其滴度测定为1.6×106PFU/mL,扩增后的滴度是1.5×109PFU/mL;取适量扩增文库稀释并铺平板,蓝白斑筛选独立噬菌斑,用M13±通用引物进行PCR扩增后,文库的重组率达到90%,插入cDNA片段的长度在0.5~2 kb。该文库的构建,有利于筛选目的基因,便于深入研究蜜蜂白垩病的侵染机制,最终有效防制白垩病。     

大片吸虫成虫cDNA文库的构建和组织蛋白酶L1基因的克隆

目的大片吸虫cDNA文库的构建及组织蛋白酶L1(Fasciola gigantica Cathepsin L1,FgCL1)基因的克隆。方法提取大片吸虫成虫总RNA,运用SMART技术构建大片吸虫cDNA文库。根据文献设计并合成PCR引物,从上述文库中克隆大片吸虫FgCL1基因,定向克隆至原核表达载体pET28a中。结果文库容量为2.08×106pfu/mL,重组率为98%。扩增后的文库滴度为6.23×109 pfu/mL,插入片段平均大小约为1 000 bp。应用两个已知基因(FgCL1 FgGST)从文库中成功钓取到相应的全长基因。将含有FgCL1的阳性克隆测序,用Genebank Blast进行序列比较,证实为FgCL1基因。结论成功构建了cDNA文库,提供筛选大片吸虫基因资源;从该文库中克隆出FgCL1,为进一步表达该基因,研制诊断试剂盒创造了条件。     

鸭胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为了解与坦布苏病毒(TMUV)E蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,本试验制备鸭胚成纤维细胞(DEF)。采用Trizol法提取细胞总RNA,通过LD-PCR技术合成双链cDNA,经CHROMA SPIN TE-400column纯化后,与pGADT7载体连接,利用同源重组的方法克隆到Y187酵母感受态细胞,构建了鸭胚成纤维细胞的cDNA文库。结果显示:构建的文库滴度为3×107 CFU/mL,文库插入的双链cDNA片段为0.5~2.5kb,平均约为1.5kb,符合酵母双杂交筛选的要求。     

柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序

采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建了柞蚕(Antheraea pernyi)蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×105个独立克隆,插入片段长800~2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因(Gen-Bank登录号:FJ788508),该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。     

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA(ds-cDNA),通过同源重组的方法构建猪IEC酵母双杂交cDNA文库。结果显示,文库的滴度为8.4×10⁸ CFU/mL,插入的ds-cDNA片段大小为0.5~2.0 kb,平均长度约为1.1 kb,文库重组率为100%。此文库为筛选与猪腹泻病毒相互作用的宿主蛋白及进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础,为研制有效的药物或疫苗提供了依据。     

MDCC-MSB1细胞酵母双杂交cDNA表达文库的构建与鉴定

提取生长状态良好的MDCC-MSB1细胞的mRNA,以5'端标记有生物素的Oligo dT primer为引物反转录,合成双链后连接Adapter。分级纯化后,通过BP重组反应构建入门文库,滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.1×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1190 bp,阳性重组率为100%。入门文库扩增后提取质粒,通过LR重组反应转化为表达文库,平均滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.2×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1087 bp,重组率为100%。构建的表达文库具有较高的质量,为研究鸡传染性贫血病毒的受体及其细胞嗜性奠定了基础。     

日本结缕草衰老叶片全长cDNA文库构建及酵母单杂交筛选验证

脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶（Pheophytin pheophorbide hydrolase,PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶,目前有关日本结缕草（Zoysia japonica）PPH基因的上游调控机制仍不是十分清楚,筛选日本结缕草ZjPPH1基因上游转录因子可以为延长绿期延缓衰老提供理论依据。本研究利用Clontech的SMRT cDNA合成技术构建一个日本结缕草衰老叶片的高质量全长cDNA文库,其滴度为2.0×10⁶ cfu·mL^-1,插入片段平均长度大于1 kb,cDNA片段插入重组率为100%。该文库的完整性较高,可涵盖绝大多数基因信息,为酵母单杂交筛选奠定了基础。利用酵母单杂交技术,筛选到可与ZjPPH1基因启动子片段结合的候选菌落42个,并对20个候选基因进行测序和生物信息学分析,初步筛选到6个参与细胞生长和衰老过程的重要候选基因,为进一步探索ZjPPH1基因在日本结缕草衰老和叶绿素降解中的上游调控机制提供了理论支撑。     

牛病毒性腹泻病毒E0-E2基因融合腺病毒的构建及小鼠免疫效果评价

【目的】 研究牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）E0和E2串联基因重组腺病毒作为基因工程疫苗的应用潜力。【方法】 采用PCR扩增、E0-E2基因融合并构建重组穿梭质粒pDC316-E0-E2,将其与AdMax腺病毒系统的骨架质粒共转染HEK293T细胞包装成重组腺病毒,通过Western blotting进行验证,并通过Reed-Muench法测定病毒滴度,通过肌内、皮下免疫接种小鼠后用ELISA方法及流式细胞检测进行免疫效果试验。【结果】 成功扩增到E0、E2基因目的片段,大小分别为681和1 122 bp,得到了完整的腺病毒Ad5-E0-E2;测定其滴度为1.1×10¹⁰ PFU/mL;Western blotting检测结果显示,Ad5-E0-E2外源基因在HEK293T细胞中表达,得到了与预期相符的目的条带（65 ku）;ELISA检测结果表明,通过肌内和皮下注射Ad5-E0-E2均能产生较高的抗体水平;流式细胞检测显示首免、二免后肌内和皮下注射Ad5-E0-E2组CD4^＋、CD4^＋/CD8^＋比值均极显著高于PBS对照组（P<0.01）。【结论】 本试验成功构建重组腺病毒Ad5-E0-E2,且具有较好的反应原性和免疫原性,能诱导机体产生针对BVDV的特异性抗体。     

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白（TRADD）相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10⁶ CFU,平均插入片段在1.5 kb左右,文库重组率>95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。     

含EGFP基因的马疱疹病毒1型新疆株gE基因缺失株的构建

为筛选马鼻肺炎（equine rhinopneumonitis,ER）基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1（登录号：KF644579.1）目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒（CMV+EGFP+polyA）为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示：经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价（10^7.1TCID₅₀/0.1 mL）较原毒株（10^8.8TCID₅₀/0.1 mL）下降约10^1.7TCID₅₀/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。     

犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库的构建

试验旨在筛选水泡性口炎病毒的受体,构建犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。通过用Trizol试剂提取犊牛口腔黏膜上皮细胞总RNA,然后分离和纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,然后用EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶消化双链cDNA末端接头,使双链cDNA 2端含有EcoRⅠ和Hind Ⅲ黏性末端。所有处理后的双链cDNA,经Mini Column 纯化,收集400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接带有EcoRⅠ和Hind Ⅲ末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示文库。经测定未扩增文库的滴度为1.3×10⁷ PFU/mL,重组率为95.8%,扩增后文库滴度为2.6×10¹⁰ PFU/mL。随机挑取100个噬菌斑进行PCR鉴定,95%的插入片段大于400 bp。结果表明成功构建了犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库。     

华支睾吸虫成虫cDNA表达文库的构建与筛选

为了获得华支睾吸虫成虫期强反应原性抗原基因,首先利用λZAP栽体构建华支睾吸虫成虫cDNA表达文库:即从我国东北疫区(镇赉县)家犬胆管内分离收集华支睾吸虫成虫,采用Trizol Reagent提取其总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第1链cDNA及第2链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与栽体λZAP Express连接,体外包装后成功获得我国东北疫区华支睾吸虫成虫cDNA表达文库.文库容量为1.5×106pfu,重组率为99%,插入片段长度在0.4～2.0 kb之阀,扩增文库的滴度为1.5×1010pfu/mL.然后利用免疫学方法对该cDNA表达文库进行筛选:以自然感染华支睾吸虫的人血清为抗体探针,从2.0×105个重组噬菌体筛选强反应原性抗原基因,对筛选出的强反应原性克隆进行测序,利用相关分子生物学软件进行序列分析.共获得41个阳性克隆,测序结果分析表明,这些cDNAs根据其编码的蛋白可分为以下几种,即与来自华支睾吸虫的甘氨酸-2、脯氨酸-2及Cs44抗原高同源的基因及分别与来自Nematostella vectensis的未知蛋白、转录延伸因子及果蝇CG3446基因编码蛋白较低同源性的基因.本研究结果为进一步对华支睾吸虫抗原的生物学特性研究及应用奠定了理论基础和实验依据.     

沙门氏菌高效价宽谱噬菌体的分离纯化及生物学特性测定

为探索控制沙门氏菌感染的新途径,本试验进行了高效价宽裂解谱噬菌体的分离。首先利用点斑试验和成斑率（EOP）测定法对环境样品进行了沙门氏菌噬菌体的分离纯化及裂解效价和裂解谱的测定,然后对其中1株效价较高、裂解谱较广的噬菌体进行了电镜形态特征观察、最佳感染复数测定、一步生长曲线测定及温度、pH和紫外线敏感性的测定。结果显示,该株噬菌体对不同沙门氏菌的裂解率不同,裂解效价在10⁹~10¹² PFU/mL;对检测的32株沙门氏菌菌株的裂解率为59.4%;透射电镜下观察到该噬菌体为头部直径约70 nm、尾部长约140 nm的长尾噬菌体;以鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028为宿主菌测得最佳感染复数为0.01;在宿主菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028中的一步生长曲线显示,潜伏期为20 min,暴发期为100 min,暴发量为113 PFU/cell;在40~60 ℃效价稳定在10¹⁰ PFU/mL,pH 5.0~13.0效价在10⁶ PFU/mL以上,紫外线照射50 min效价仍有10⁶ PFU/mL。综上可知,该株噬菌体分离株具有效价高、裂解谱宽且对温度、pH、紫外线稳定性良好等特性,符合噬菌体制剂的相关特征,具备作为噬菌体制剂后备菌株开发的潜力。