生物反应器中PRRSV工业规模增殖工艺的建立

分析比较了3种不同微载体悬浮培养工艺——分批换液式、消化传代放大式、循环灌注培养式对Marc-145细胞微载体培养效能及生理代谢的特点及差异,并实现了从5 L至60 L反应器放大过程的PRRSV实际增殖应用。结果表明,在5 L动物细胞反应器中使用相同的微载体用量6 g/L,分批换液式培养和消化传代放大式培养仅获得27×105~28×105cells/m L的细胞密度,低于循环灌注培养式的培养能力(59.4×105cells/m L)。根据这3种不同培养工艺的特点,设计并实施了可应用于实际生产的工艺流程,即Marc-145种子细胞以循环灌注培养方式在5 L反应器中完成初级培养,经消化传代工艺,将种子细胞放大接种于60 L反应器中进行分批换液式的二级培养,用于PRRSV的大规模增殖,结果显示PRRSV增殖滴度可达到108.3TCID50/m L。该过程成功地模拟了Marc-145细胞在工业级水平上的放大培养操作工艺,其放大倍数达到1∶3的传代系数,具备实际应用价值。     

Marc-145细胞微载体模化培养PRRSV

为确定甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上最佳增殖条件。将PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上增殖,以半数细胞感染剂量为检测指标,对病毒维持液中血清浓度、接毒时间、感染复数(MOI)和收毒时间进行优化。结果表明,细胞培养后72 h接种病毒,病毒维持液中血清含量为2%,病毒感染复数为0.05,病毒感染48 h后PRRSV效价较高达到10~(6.6)TCID_(50)·mL~(-1),确定了PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上的增殖条件。     

PK-15细胞在微载体悬浮放大培养及PCV2增殖工艺研究

为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术。采用分批式培养方法,研究了PK-15细胞在微载体胰酶消化放大悬浮培养及猪圆环病毒2型(PCV2)增殖工艺。结果表明,5 g/L的微载体和高糖DMEM下,采用4.0×105cells/m L的初始接种密度及培养至第2天进行换液操作工艺可以获得最佳的PK-15细胞生长效能。胰酶消化转移将PK-15细胞从1 L反应器放大至3 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,培养3 d细胞密度可达34.3×105cells/m L。采用感染复数为0.1的接毒比例,细胞接毒后在微载体上传至第3代收获毒液可获得最高的PCV2增殖效价107.25TCID50/m L。为PCV2疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

PRRSV的分离与鉴定

从猪场疑似猪繁殖和呼吸综合症的病死仔猪肺脏和脾脏中分离到一株致Marc-145细胞病变的病毒,RT-PCR检测确诊为猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV),按Reed-muench法计算TCID50结果显示该分离病毒株在Marc-145细胞上的增殖毒价为106.75TCID50/ml。     

重组猪α干扰素抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞增殖的初步研究

采用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)/Marc-145细胞体系验证重组猪α干扰素(rPolFN-α)制剂的抑制病毒作用.结果表明:rPolFN-α稀释至1010可有效预防PRRSV感染Marc-145细胞;当rPolFN-α稀释至1010可有效抑制病毒在Marc-145细胞上的增殖.研究结果在细胞水平上明确了rPoIFN-α对PRRSV的抑制作用,为进一步将rPoIFN-α应用于动物试验提供了参考.     

Marc-145细胞无血清培养驯化、代谢分析及PRRSV增殖能力比较

采用逐步降低培养液中血清用量的方法对Marc-145细胞进行无血清培养驯化并考察其生长代谢、增殖PRRSV(猪繁殖及呼吸综合征病毒)的能力.结果表明,通过在细胞对数生长期更换低浓度血清的培养液或传代操作,Marc-145细胞可完全适应含5％新生牛血清的营养条件,经3次传代后,Marc-145细胞可营正常贴壁生长.然而在1％新生牛血清的营养条件下,初次培养于该条件的Marc-145细胞伪足不伸展,贴壁时间明显延长.经过在该1％血清浓度下10次传代后,Marc-145细胞可贴壁生长,维持较高的存活率,但贴壁较松.由此Marc-145细胞进一步驯化适应无血清悬浮培养条件,筛选获得能够在无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞,且生长状态良好.比较在不同血清浓度及不同培养方式下生长的Marc-145细胞增殖PRRSV的能力,无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞对PRRSV的增殖性能没有改变.     

无血清微载体培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒

为了获得用生物反应器无血清培养基微载体悬浮培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的工艺参数,通过驯化Vero细胞适应无血清微载体悬浮培养后,再优化传染性法氏囊病毒在此细胞上的增殖工艺参数,包括初始细胞密度、微载体浓度、IBDV的感染复数(MOI)、接种时间和病毒收获时间。结果表明:获得适应无血清培养的细胞株——V0株,建立细胞库。获得3 L反应器中培养V0细胞增殖IBDV工艺参数,其初始接种密度为3×105cell/m L、微载体浓度为3 g/L、细胞培养1 d后按MOI为0.2接种IBDV,接毒后120 h收获病毒,可达最高病毒效价109.307TCID50/m L。本研究获得的Vero细胞、IBDV以及各项工艺参数为后续大规模悬浮培养制备法氏囊疫苗提供了生物材料和技术支持。     

表达PRRSV 强弱毒Nsp2的Marc 145细胞系的建立及Nsp2蛋白对PRRSV复制的影响

为探讨Nsp2蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的影响,采用体外克隆法构建表达高致病性PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株Nsp2基因的真核表达质粒pEGFP-TJ Nsp2和pEGFP-TJMNsp2,含有增强式绿色荧光蛋白表达盒,瞬时转染重组质粒到Marc-145细胞系单层,利用G418抗性筛选建立细胞系,通过PCR和RT-PCR鉴定。PRRSV感染筛选的细胞系,检测病毒TCID50。结果建立稳定表达TJ株和TJM株Nsp2基因的猴肾细胞系Marc-145-TJ Nsp2和Marc-145-TJM Nsp2;在表达PRRSV TJ株和TJM株Nsp2蛋白的Marc-145细胞上感染PRRSV病毒,在复制早期病毒时增殖速度快,即Nsp2蛋白对PRRSV复制早期有正向调控作用,并且强毒的Nsp2此作用更明显。     

兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒血清在Marc-145细胞上对病毒复制影响

制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,探索其对病毒复制影响,通过大量培养猪繁殖与呼吸综合征病毒XH-GD株病毒,高速离心后蔗糖梯度纯化浓缩并免疫新西兰大白兔,4免后采集抗血清,ELISA法测定效价。同时将抗血清与病毒共同孵育接种Marc-145细胞,荧光定量PCR和TCID50测定病毒复制情况。成功制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,效价达1640,抗血清可以在m RNA水平和TCID50上降低病毒滴度。结果表明,兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清可以在Marc-145细胞上抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制。     

抗蓝耳病shRNA转基因表达载体的构建与功能验证

将靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24 h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.试验结果表明:所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.     

猪波形蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用

为了研究波形蛋白在介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染细胞过程中的作用,利用RT-PCR方法从PRRSV非易感细胞系猪肾细胞系PK-15细胞中扩增目的基因,克隆入pET-28a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。表达的重组猪波形蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用病毒抑制试验检测重组猪波形蛋白及多克隆抗体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用。结果表明,成功扩增猪波形蛋白基因并克隆入pET-28a载体,经诱导后得到高效表达,纯化后免疫兔子产生高价血清抗体(105)。病毒阻断结果表明,猪波形蛋白及多克隆抗体均能阻断PRRSV感染Marc-145细胞。这为以波形蛋白为基础的PRRSV受体阻断抑制剂的研究提供了实验依据。     

抗猪FcγRⅡb多抗阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体依赖增强作用研究

为验证猪FcγRⅡb在抗体依赖增强(ADE)作用中的功能,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清中提取IgG并制备F(ab′)2片段,将104 TCID50的PRRSV病毒与80μg/mL的F(ab′)2片段或抗PRRSV阳性血清(中和效价1/5.9,经128倍稀释)混合,共同感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞,发现亚中和滴度的阳性血清能显著增强病毒对PAM的感染,但不能增强病毒对Marc-145细胞的感染;而F(ab′)2片断不能增强病毒感染;用兔抗猪FcγRⅡb多抗孵育PAM细胞,再用上述病毒与阳性血清复合物感染PAM,结果阳性血清对病毒感染的增强作用受到明显抑制。表明猪FcγRⅡb能够介导PRRSV ADE作用。     

Marc-145细胞低血清适应培养传代稳定性和无血清驯化研究

通过驯化建立无血清悬浮培养型Marc-145细胞系,分析驯化传代对细胞特性的影响,为大规模生产疫苗用的宿主细胞提供基础。采用缓降培养液中血清浓度的方法,连续传代培养50代,并用无血清培养基进行悬浮培养驯化,对传代和驯化过程中的P10、P20、P30、P40和P50代细胞的形态、倍增时间、生长曲线、染色体和对蓝耳病病毒敏感性等特性进行对比分析。研究发现,传代过程中Marc-145细胞均呈扁平多边形上皮样生长,P10代细胞倍增时间为34.15 h,P50代细胞倍增时间为36.16 h,P50代细胞倍增时间稍有延长但差异不显著。P10、P20、P30、P40和P50代的Marc-145细胞生长曲线均呈“S”形;P10代和P50代细胞染色体众数都集中在88~90条。接种病毒后,P10、P20、P30、P40和P50细胞TCID₅₀间无显著差异,表明细胞传50代后,细胞特性没有发生明显变化。P50细胞进行无血清悬浮培养48 h后,细胞密度可达到4.14×10⁶ mL^-1。     

猪CD151重组抗原表达及其免疫血清的PRRSV感染抑制作用

用RT-PCR从猪巨噬细胞中扩增CD151胞外区编码序列,将其插入含细胞毒性T细胞相关抗原4胞外区序列的表达载体,重组载体转化大肠杆菌,SDS-PAGE检测重组蛋白表达;用包涵体纯化和尿素变性与复性法获得可溶性蛋白,纯化蛋白免疫小鼠,ELISA测定免疫血清抗体效价,Western-blot验证免疫血清特异性;以处理细胞或处理病毒方式,用免疫血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染抑制试验。结果表明:重组菌表达预期的32ku重组蛋白,获得的可溶性重组蛋白纯度较高;免疫血清抗体效价达1∶170 000,在猪巨噬细胞中能检测到预期的29ku蛋白,能抑制PRRSV感染MARC-145细胞,但有毒株差异性,处理病毒的感染抑制作用较强。结果提示猪CD151免疫血清能以结合细胞和结合病毒方式抑制PRRSV感染。     

芪板青颗粒体外抗PRRSV效果研究

为了检验芪板青颗粒体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒效果,降低养猪场因感染猪繁殖与呼吸综合征病毒带来的损失,本试验通过调整芪板青颗粒溶液与猪繁殖与呼吸综合征病毒液加到Marc-145细胞中的不同顺序,分别检验芪板青颗粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制、杀灭和阻断作用。结果显示：芪板青颗粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒有一定的抑制、杀灭和阻断作用,在芪板青溶液浓度为24.4～3 125.0 mg/L时,有显著的抑制和杀灭猪繁殖与呼吸综合征病毒作用,在浓度195.3～3 125.0 mg/L时,有显著的阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒作用。结果表明：芪板青颗粒可用于体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒,本试验为芪板青颗粒的应用提供了依据,为猪繁殖与呼吸综合征的防治提供了帮助。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒样品对细胞的敏感性

从疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的发病猪场采集组织和血清样品并按病料分成2组,通过反转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测样品中高致病性PRRSV发生变异的Nsp2部分基因,初步筛选出PRRSV阳性样品后分别通过Marc-145和PAM细胞分离培养。结果表明：从45份阳性病料中成功分离到29份高致病性PRRSV,其中从血清样品中成功分离的约占总数72.5%,从组织样品中成功分离的约占总数27.5%;通过Marc-145细胞分离获得的病毒有19份,通过PAM细胞分离获得的有24份,其中有14份是Marc-145和PAM共同分离得到。试验获得的血清是高致病PRRSV分离的理想样品,该病毒对Marc-145和PAM细胞的敏感性差异不显著。     

猪繁殖—呼吸综合征病毒上海分离株的病毒特性研究

对猪繁殖－呼吸综合征病毒（PRRSV）上海分离株（SH1）的理化特性和结构蛋白进行研究。结果表明，SH1分离株能致Marc-145细胞典型病变，TCID50为10^5.0mL^-1。对氯仿和乙醚、酸（pH5．5以下）、碱（pH8以上）、热（水浴56℃10min以上、37℃24h以上、28℃48h以上）均敏感。病毒负染可见以具囊膜的球形为主，囊膜上有纤突，大小为60－85nm。超薄切片可见病毒存在于细胞浆中。SH1分离株的病毒培养液经差速离心和非线性蔗糖密度梯度纯化，SDS－PAGE显示病毒结构蛋白的相对分子质量24000，19500，16000。免疫转印可见3条结构蛋白均能被PRRSV美洲株高免血清识别。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP4细胞核定位研究

为探讨PRRSV非结构蛋白4(NSP4)功能,体外构建了pEGFP-N1-nsp4真核表达载体,转染Marc-145细胞,利用NSP4-GFP融合蛋白携带的绿色荧光标记,研究NSP4蛋白在Marc-145细胞中的定位,并根据蛋白疏水性设计构建含有nsp4基因N端不同长度的重组pEGFP-N1表达载体,转染细胞以进一步了解NSP4蛋白是否存在核定位信号序列及其在细胞中的分布。试验结果表明:融合蛋白主要位于细胞核,部分在胞浆内。PRRSV NSP4蛋白铰链区(hinge region,HR)145～168氨基酸是决定蛋白核内定位的功能区,该片段缺失影响NSP4蛋白进入细胞核。结论:体外转染细胞内表达的NSP4蛋白主要分布在细胞核内,HR区是其核定位信号,NSP4蛋白通过HR区信号作用主动进入细胞核内。     

Study on Propagation of Chicken Infectious Bursal Disease Virus on Vero Cells Using Microcarriers in Fermentor

It was in flask optimization tests proved that 2% serum, pH 7.0, 5:10 000 inoculation concentration of infectious bursal disease virus (IBDV) and 108 hours cultivation for IBDV harvest after its inoculation were the optimal conditions when IBDV was propagated on Vero cells. 250 mi self-made spinner bottle and 5 L stirring fermentor tests proved that IBDV could maintain higher titers for a long time and the highest titers of IBDV in a spinner bottle and a fermentor were 8. 875 and 8.58 ( - lgTCID50/0.1 ml) respectively when IBDV was proliferated on Vero cells using 2 g/L microcarriers in a spinner bottle and a fermentor and was cultivated under the optimum conditions obtained from flask tests after Vero cells had developed a confluent monolayer on microcarriers, which were at least one titer higher than the highest titer in the traditional rolling bottle. All these results suggested that this technology could be applied to large scale production for IBDV.