Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立

采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

DF-DF-1细胞的保存期试验及致瘤性鉴定

为研究DF-1细胞的保存期及其传代过程中的稳定性和安全性,将来源于ATCC的DF-1细胞建立细胞库,取液氮保存12、24及48个月的DF-1细胞复苏,经3次传代后,观察不同批次细胞的生长特性并接种鸡传染性法氏囊病病毒,研究各批次细胞出现病变的时间及病毒含量;同时制备不同代次细胞的染色体并进行核型分析;对基础细胞库14代和最高代次60代的DF-1细胞进行致瘤性检测。结果显示,DF-1细胞在液氮中保存48个月,对细胞生长特征及增殖病毒无明显影响,经传60代后的细胞,染色体核型无明显差异且无致瘤性,表明DF-1细胞在传代过程中是稳定且安全的。     

Marc-145细胞无血清培养驯化、代谢分析及PRRSV增殖能力比较

采用逐步降低培养液中血清用量的方法对Marc-145细胞进行无血清培养驯化并考察其生长代谢、增殖PRRSV(猪繁殖及呼吸综合征病毒)的能力.结果表明,通过在细胞对数生长期更换低浓度血清的培养液或传代操作,Marc-145细胞可完全适应含5％新生牛血清的营养条件,经3次传代后,Marc-145细胞可营正常贴壁生长.然而在1％新生牛血清的营养条件下,初次培养于该条件的Marc-145细胞伪足不伸展,贴壁时间明显延长.经过在该1％血清浓度下10次传代后,Marc-145细胞可贴壁生长,维持较高的存活率,但贴壁较松.由此Marc-145细胞进一步驯化适应无血清悬浮培养条件,筛选获得能够在无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞,且生长状态良好.比较在不同血清浓度及不同培养方式下生长的Marc-145细胞增殖PRRSV的能力,无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞对PRRSV的增殖性能没有改变.     

响应面法优化大肠埃希菌生产PCV2 Cap蛋白的诱导条件

为提高重组大肠埃希菌发酵生产PCV2Cap蛋白的产量,优化宿主菌的表达条件。在单因素试验基础上,以接种量、诱导时间和诱导温度为自变量,目的蛋白产量为响应值,根据响应面法的Box-Behnken中心组合设计原理,研究各自变量及其交互作用对PCV2Cap蛋白产量的影响,利用Design-Expert软件和响应面分析相结合的方法对诱导条件进行优化。结果表明:发酵的最佳诱导条件为接种量φ=2.21%,诱导时间21.76h,诱导温度18.2℃。在该诱导条件下,摇瓶中获得最高蛋白产量为318.50mg/L,发酵罐获得最高蛋白产量为1 200.00mg/L。采用响应面分析方法能够有效地提高目的蛋白的表达量。