基因4型HEV上海株ORF_2编码蛋白表达及其抗原性分析

为了表达基因4型戊型肝炎病毒(HEV)上海株ORF2编码蛋白并分析其抗原性,采用套式RT-PCR方法扩增上海猪基因4型HEV代表株结构蛋白基因ORF2部分片段,构建含有该基因片段的pET30a(+)重组表达质粒,命名为pET-E;将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,经1mmol/L IPTG诱导得到表达,进行SDS-PAGE分析,然后用Western blot鉴定其抗原性,最后纯化蛋白。结果:SDS-PAGE证明该片段得到融合表达,分子量为33 ku。Western blot分析表明,重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性;该融合蛋白含有组氨酸标签,可以用MagExtractor-His-tag-kit进行纯化。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测89份猪血清样品,阳性率达80.4%,与已有的试剂盒检测结果相比,阳性符合率达95%。     

基于绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白间接ELISA方法的建立

为解决绵羊肺炎支原体感染的预防问题,建立一种简单、快速、成本低的诊断方法,构建绵羊肺炎支原体EF-Tu基因原核表达载体,诱导纯化重组蛋白并用Western blot分析其反应原性,以重组蛋白为诊断抗原,建立绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法,评估其特异性和灵敏性。结果表明,构建的重组蛋白纯化后,经Western blot证实具有良好的反应原性;间接ELISA反应条件优化显示,抗原稀释度为0.25μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶50,最佳孵育时间为90 min,封闭液为50 g/L脱脂奶粉,二抗最佳稀释倍数为1∶8 000,最佳孵育时间为60 min,特异性与灵敏性良好;该方法与间接血凝法对100份血清进行检测,两者符合率为88.7%。说明试验建立的绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法可以推广使用。     

TGEV S基因原核表达及表达蛋白间接ELISA方法的建立与初步应用

为了建立检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),试验参照GenBank公布的TGEV TH-98株S基因序列,设计合成1对引物,RT-PCR扩增相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-32a中,以大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞为表达菌株进行诱导表达。再以纯化重组蛋白作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等参数建立检测TGEV S蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明:试验成功克隆了TGEV S基因,扩增片段长度为4 003 bp;构建了重组表达质粒pET-S,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得高效表达,表达蛋白分子质量约为148 ku;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot分析显示,重组蛋白具有良好的抗原性;以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,建立了TGEV S蛋白抗体检测间接ELISA方法;该ELISA方法的抗原最佳包被浓度为18.85μg/mL,最适血清稀释比例为1∶40。     

坏死梭杆菌白细胞毒素基因的BSBSE片段的原核表达及抗血清制备

本研究以国内分离的牛源坏死梭杆菌F4基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增BSBSE片段,克隆到pMD18-T载体上,鉴定并测序正确后,构建pET32a-BSBSE表达质粒,转化E．coli BL21（DE3）经IPTG诱导、SDS—PAGE检测重组蛋白表达、Western blot检测重组蛋白反应原性。以该重组蛋白免疫兔制备抗血清,经间接ELISA检测抗血清效价。结果表明,PCR扩增得到1100bp的BSBSE片段,以此片段构建了pET32a—BSBSE表达质粒,经诱导后获得了目的蛋白表达,以Western blot检测该重组蛋白证明为本研究的目的蛋白,并且与抗体具有反应原性。以间接ELISA检测该重组蛋白免疫兔制备的抗血清效价达10^5。研究结果将为坏死梭杆菌毒力因子（1kt）的深入研究奠定了物质基础。     

猪戊型肝炎病毒血清抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

由于猪戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)可跨种属感染人,因此,猪群中猪HEV感染的监测对于该病的防控和公共卫生都具有重要的意义。本试验旨在建立一种检测猪HEV抗体的间接ELISA方法,以原核表达纯化截短的猪HEV衣壳蛋白为包被抗原,优化条件,确定最佳试验条件,并分析该方法的敏感性、特异性、重复性,以及与商品化试剂盒的符合率,评价其临床应用价值。SDS-PAGE和Western blot结果证明抗原蛋白获得正确表达与纯化,并且具有良好的反应原性,可以作为后续建立ELISA方法的包被抗原。通过优化ELISA条件,最终确定抗原最佳包被量为200ng·孔-1,血清最佳稀释度为1∶200,包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(pH 9.6),封闭液为2.5%的脱脂奶粉,阴阳性判定的临界值为OD450nm≥0.296。该间接ELISA方法的特异性和敏感性良好,板内和板间变异系数均小于10%,与北京万泰商品化试剂盒符合率为91.2%。临床应用表明,该方法可应用于猪HEV感染猪后抗体消长以及临床猪血清抗体的检测。因此,本研究建立的猪HEV抗体间接ELISA检测方法具有较好的敏感性和特异性,准确率较高,该方法适用于临床猪血清样品的检测和猪HEV感染血清流行病学的调查。     

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段的表达、纯化及抗原性分析

根据已克隆的戊型肝炎病毒株swCH189株结构蛋白基因（ORF2）的抗原性及水溶性分析,在其序列上设计套式引物,采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒（HEV）结构蛋白基因ORF2主要抗原基因片段,长度为728bp,将其克隆于PMD18-T载体,测序结果表明插入的片段属于猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因ORF2部分;将该片段插入pet32a表达载体,经酶切、测序鉴定证实获得了带有目的基因的重组表达质粒。将重组质粒转化Rosetta菌,经0.3mmol/L IPTG诱导得到融合表达,得到相对分子质量为45 000的重组蛋白,以包涵体形式存在。Western blot分析表明,该蛋白可以与猪戊型肝炎阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。并用SDS电泳切胶纯化和透析浓缩方法进行纯化,用纯化的蛋白免疫兔子,经每2周免疫1次,连续3次免疫后,对免疫组和对照组,分别在45,60,90d采血,每只兔子采集1份。用夹心ELISA法测定免疫血清抗体,结果表明免疫组在45d后均产生具有HEV抗原结合活性的抗体。本试验对猪swCH189株CP239基因的克隆和表达研究,为进一步研究结构蛋白基因ORF2的生物学功能奠定了基础。     

B亚型禽偏肺病毒重组G蛋白间接ELISA方法的建立及应用

以纯化的B亚型禽偏肺病毒(aMPV)疫苗株(VIR-115 B)重组G蛋白作为包被抗原,对各项条件进行优化,确定判定标准,建立检测B亚型aMPV抗体的间接ELISA方法.将构建好的重组质粒转入Rosetta (DE3)感受态细胞进行诱导表达,获得重组G蛋白.利用亲和层析法对表达产物进行纯化,并用Western-blotting对表达产物进行鉴定.以纯化后的重组G蛋白作为诊断抗原,对ELISA反应条件进行优化,初步建立检测B亚型aMPV抗体的间接ELISA诊断方法.结果显示,成功表达并纯化了B亚型aMPV疫苗株(VIR-115 B)重组G蛋白,Westernblotting检测结果证明表达产物具有良好的反应原性.以重组G蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法.交叉试验结果表明重组G蛋白与新城疫、禽流感(H9N2)、传染性支气管炎和传染性法氏囊阳性血清均不发生交叉反应.该方法与法国IDEXX公司生产的aMPV抗体检测试剂盒符合率为96.0％.采用本试验建立的间接ELISA方法对山东省7个地区鸡场的1 139份鸡血清进行了检测,结果表明,山东省部分地区aMPV的抗体阳性率为37.05％.本试验建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,利用该方法初步证实山东省部分地区存在aMPV感染现象.这一研究为aMPV诊断试剂盒的研制奠定了基础,并为该病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段.     

猪戊型肝炎病毒ORF2片段克隆及原核表达

设计套式引物，内套引物含有BamHⅠ／XhoⅡ酶切位点，采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒（UEV）结构蛋白基因ORF2部分片段，长度为634bp，将其克隆于PGEX-T载体，测序结果表明插入的片段属于戊型肝炎病毒ORF2部分，将该片段插入PproEXHTb表达载体，经酶切鉴定证实获得了重组表达质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21，经1mmol／L IPTG诱导，得到表达，表达蛋白分子量为27Ku，以包涵体形式存在。Western blot分析表明，该蛋白可以与猪戊型肝炎阳性血清反应，表明该蛋白具有良好的反应原性。     

猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立以猪附红细胞体α-烯醇化酶(ENO)重组蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法。本实验将猪附红细胞体ENO基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-ENO,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,并对其表达产物纯化及western blot鉴定。以ENO重组蛋白为包被抗原,优化反应条件,建立了猪附红细胞体ENO基因的间接ELISA检测方法。结果显示,经原核表达获得了分子量约为69 ku的重组蛋白,主要以可溶性形式存在;经western blot鉴定,纯化后的蛋白具有良好的反应原性。以纯化的ENO重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法,优化后的反应条件为:抗原的最适包被浓度为20.5μg/mL;最佳封闭条件为3%的脱脂乳封闭2 h;待检血清最适稀释倍数为1:80;兔抗猪HRP-IgG最佳稀释倍数为1:1 000;OPD显色时间为15 min;特异性试验结果显示,所建立的间接ELISA检测方法与猪弓形虫、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、猪链球菌等均无交叉反应;该方法检测猪附红细胞体阳性血清的灵敏度为1:320;批内和批间重复性变异系数均低于5%;应用所建立的间接ELISA检测方法与IFA检测方法平行检测50份采自延边地区某猪场的猪血清样本,两种方法的总符合率为90%。本研究建立的间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可初步应用于猪附红细胞体血清学检测。     

鸡白痢沙门氏菌IPAJ蛋白的表达纯化、多克隆抗体制备及ELISA方法的建立

【目的】试验旨在建立以鸡白痢沙门氏菌的毒力相关基因所编码的IPAJ蛋白为抗原的间接ELISA方法。【方法】PCR扩增IPAJ基因并连接到pCzn1表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPAJ基因重组蛋白用IPTG进行诱导表达并纯化,通过Western blotting验证蛋白的反应原性。用纯化的IPAJ蛋白免疫60日龄试验兔,共免疫3次,制备其多克隆抗体,通过ELISA方法检测抗体效价。采用方阵滴定法优化以IPAJ蛋白作为诊断抗原的ELISA条件,初步建立以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,并与平板凝集试验结果进行比较。【结果】试验成功构建鸡白痢沙门氏菌IPAJ原核表达载体,并以包涵体形式纯化出重组蛋白,具有良好的反应原性。Western blotting分析结果显示,成功表达出32 ku的IPAJ蛋白,具有良好的特异性。间接ELISA检测结果显示,多克隆抗体效价为1∶25 600,表明成功制备出多克隆抗体。建立的以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法的最佳优化条件为：抗原包被浓度为5μg/mL,5%脱脂奶粉封闭1.5 h,一抗最佳稀释浓度为1∶250...     

猪圆环病毒2型ORF2基因截断表达及ELISA抗体检测方法的初步建立

为建立以重组PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建了猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因原核表达质粒pET28a-ORF2。SDS-PAGE显示,在0.1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导4h,重组Cap蛋白高效表达。Western blotting证实该蛋白能够被PCV2阳性血清特异性识别。以纯化的蛋白为抗原建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最适包被质量浓度为2mg/L;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗最适浓度为1∶2 000,该方法的敏感性为86.96%,特异性为100%。用该方法对河南省152份猪血清样品进行检测,与间接免疫荧光（IFA）的符合率为85.53%（130/152）,与商品化的韩国金诺PCV2ELISA试剂盒的符合率为88.16%（134/152）。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。     

多头带绦虫蛋白激酶A催化亚基基因的克隆及原核表达

为鉴定多头带绦虫蛋白激酶A催化亚基（TmPKA-C）基因作为诊断抗原的潜能,本试验以多头带绦虫成虫RNA为模板,利用RT-PCR扩增TmPKA-C基因。将TmPKA-C基因片段连接至pET-30a原核表达载体进行原核表达,然后利用Western blotting和间接ELISA分析该蛋白的反应原性。结果表明,TmPKA-C基因开放阅读框的长度为1 032 bp,可编码343个氨基酸。TmPKA-C基因的表达产物主要以包涵体的形式存在,重组蛋白的分子质量大小约42 ku。Western blotting结果表明,该重组蛋白既能与自然感染脑多头蚴的绵羊血清发生特异性反应,又能与人工感染脑多头蚴不同时间段的绵羊血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。间接ELISA分析结果表明,脑多头蚴绵羊血清能与重组蛋白发生特异性反应,进一步证明该重组蛋白的反应原性良好。本研究为筛选脑多头蚴病诊断新抗原奠定了基础。     

Cloning and Prokaryotic Expression of Protein Kinase A Catalytic Subunit Gene from Taenia multiceps

To study the potential of protein kinase A catalytic subunit of Taenia multiceps (TmPKA-C) gene as a diagnostic antigen, the TmPKA-C gene was amplified by RT-PCR from the total RNA of Taenia multiceps. The TmPKA-C gene fragment was ligated into prokaryotic expression vector pET-30a and transformed into Escherichia coli Transetta (DE3) strain, then the reactonogenicity of recombinant TmPKA-C protein was analyzed by Western blotting and indirect ELISA. The open reading frame of TmPKA-C gene was 1 032 bp, encoding 343 amino acids. The expression product of TmPKA-C gene mainly existed in the form of inclusion body, and the molecular weight of recombinant protein was about 42 ku. Western blotting analysis showed that the recombinant protein could react specifically with the sera from naturally infected sheep with coenurosis, and it could also have specific reaction with the sera of artificial infected sheep with coenurosis. The indirect ELISA analysis showed that the sera from the coenurosis of sheep could react specifically with the recombinant protein. These results proved that the recombinant protein had good reactionogenicity. This study laid a foundation for the search of new diagnostic antigens for coenurosis of sheep.     

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。     

非洲猪瘟间接ELISA诊断试剂盒的研究

用带有编码非洲猪瘟病毒衣壳蛋白Ｐ７２ 基因的重组杆状病毒（Ｂａｃｐ７２）作载体,在ｓｆ９细胞中表达并得到重组Ｐ７２蛋白,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ可得到分子量在 ７２ｋＤａ左右的电泳带。用标准阳性非洲猪瘟血清对 Ｐ７２蛋白进行 ＥＬＩＳＡ检测,证明该蛋白具有生物学活性。用Ｐ７２作为间接法的包被抗原,对ＥＬＩＳＡ反应条件进行了优化。确定最佳包被液为ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、最佳封闭液为１％ＰＣＴ、最佳血清稀释液为４％ＰＥＧ６０００／ＰＢＳ、最佳冲洗液为０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）。本实验反应体系采用５０μｌ的微量法,可节约试剂及抗原。反应在２小时内即可完成,达到了快速诊断的目的。包被了抗原并用封闭液封闭后的酶标板密封后保存于－２０℃的冰箱中,至少可以保存５个月。阻断试验和交叉试验表明ＥＬＩＳＡ法有良好的特异性。间接ＥＬＩＳＡ比Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法具有更高的灵敏性。血清学调查没有得到阳性结果,与我国实际情况相符。用Ｂａｃｐ７２表达的非洲猪瘟病毒Ｐ７２蛋白抗原作为间接ＥＬＩＳＡ的检测抗原来检测非洲猪瘟血清具有快速、简单、无感染的特点。本实验为非洲猪瘟ＥＬＩＳＡ检测试剂盒的最终组装提供了实验依据。     

非洲猪瘟病毒p22蛋白表达、多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立

【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具...     

布鲁氏菌Omp19基因的生物信息学分析、克隆表达和ELISA方法的初步建立

为了进一步研究布鲁氏菌外膜蛋白19（outer membrane protein 19,OMP19）的结构与功能,并获得具有反应原性的OMP19重组蛋白,建立布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法,试验通过生物信息学软件对OMP19蛋白进行氨基酸序列分析,经PCR技术克隆Omp19基因,利用无缝克隆技术构建重组表达载体pET-32a-Omp19,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导其表达并纯化,并通过Western blotting和ELISA分析方法分别检测OMP19蛋白的反应原性,以建立基于该蛋白的间接ELISA方法。结果显示,OMP19蛋白N端有19个信号肽序列,二级结构以无规则卷曲为主,且OMP19蛋白含有优势抗原表位,利用PCR技术和无缝克隆技术成功构建了Omp19基因的原核表达载体pET-32a-Omp19,成功诱导表达并纯化了OMP19融合蛋白,大小约为35 ku,与理论值相符,并通过Western blotting和ELISA方法鉴定OMP19的反应原性,结果表明该蛋白具有较好的反应原性,且包被浓度为10 μg/mL,一抗稀释比为1：50,二抗稀释比为1：8 000时,P/N值最大,为2.80。本研究结果为布鲁氏菌病快速诊断方法的建立和新型疫苗的研发奠定了理论基础。     

布鲁菌bp26基因的表达与bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

为了研制布鲁菌bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒,将布鲁菌bp26基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,以纯化后的重组蛋白bp26包被酶标板,优化ELISA反应条件,组装试剂盒。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,重组蛋白分子质量约为41 ku,经IPTG诱导后高效表达,且具有良好的免疫原性;优化试验确定重组抗原最佳包被浓度为3.6 μg/mL,血清样本的阳性临界值为0.370;特异性试验结果表明,重组蛋白与牛结核菌、副猪嗜血杆菌、链球菌等多种病原体的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验结果表明,血清稀释至1:12800时,仍检测为阳性;该试剂盒的批内、批间变异系数均小于10%;用该试剂盒检测241份临床牛血清样本,并与试管凝集试验(SAT)检测结果比较,两者符合率为97.1%。原核表达的布鲁菌bp26具有良好的免疫原性,研制的布鲁菌bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒敏感性、特异性和重复性较好,可为布鲁菌基因缺失标记疫苗的应用提供配套的血清学诊断方法。     

Bioinformatics Analysis,Cloning and Expression of Omp19 Gene of Brucella and Preliminary Establishment of ELISA Method

This study was aimed to further investigate the structure and function of Brucella outer membrane protein 19 (OMP19),obtain the recombinant protein of OMP19 with reactivity,and establish the new method for diagnosing brucellosis based on indirect ELISA.The amino acid sequence of OMP19 protein was analyzed by bioinformatics software,Omp19 gene was amplified by PCR,and the recombinant expression vector pET-32a-Omp19 was constructed by seamless cloning method,it was transformed into E.coli BL21 (DE3) competent cells,induced and purified OMP19 protein.The immunogenicity of OMP19 protein was detected by Western blotting and ELISA,respectively,to establish an indirect ELISA method based on the protein.The results showed that there were 19 signal peptide sequences in the N terminal of OMP19 protein,and the secondary structure was random coil,and OMP19 protein contained dominant antigenic epitopes.The prokaryotic expression vector pET-32a-Omp19 was successfully constructed by PCR and seamless cloning method,the OMP19 fusion protein was successfully induced,expressed and purified,the size of protein was about 35 ku,which was consistent with the expect size.The reactivity of OMP19 was identified by Western blotting and ELISA,the results showed that the fusion protein had good reactivity,and the coating concentration was 10 μg/mL.The dilution ratio of the first antibody was 1：50 and the second antibody dilution ratio was 1：8 000,the P/N value reach the highest at 2.80.The results laid a foundation for the establishment of rapid diagnosis of brucellosis and the development of new vaccine.     

牛环形泰勒虫裂殖子/梨浆虫表面抗原基因非疏水区的克隆及GST-P27重组蛋白的高效表达

A fragment about 696 bp was amplified by PCR technique with specific primers based on Tams1 gene sequence（AF214842） of Theileria annulata reported in GenBank. Then the target fragment was directionally cloned into pGEX-4T-2 expression vector, the recombinant plasmid DNA was cut by enzymes, and then sequenced.The result showed that the homology of the cloned Tams1 gene was 98%. The positive plasmid was transformed into BL21（DE3）, and then induced by IPTG. Soluble fusion protein whose expression level reached 1.39 mg/mL was obtained when it was induced with 0.5 mmol/L IPTG for 4 h at 37 ℃, and it was 53 ku. Western blotting showed that recombinant protein GST-P27 which was purified by Glutathione Sepharose 4B had the favorable reactionogenicity.