1株B亚型禽偏肺病毒的分离与鉴定

从山东省多个地区的商品肉鸡养殖场采集64份疑似病料,通过RT-PCR方法检测出37份禽偏肺病毒阳性病料,以此作为病毒分离材料接种SPF鸡胚,盲传至第7代时鸡胚生长明显迟滞。取阳性尿囊液在CEF中培养,呈现禽偏肺病毒典型细胞病变(CPE):细胞变圆、悬浮,有合胞体形成。将分离株接种于Vero细胞及DF-1细胞均出现类似病变。对分离株F基因进行测序,并与GenBank中发表的部分代表序列比较。结果显示,与B亚型禽偏肺病毒的核苷酸同源性最高,为97.4%⁹9.3%;与A亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性较低,为77.4%99.3%;与A亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性较低,为77.4%⁷8.1%;而与C亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性最低,为69.5%78.1%;而与C亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性最低,为69.5%⁶9.7%。基因分型显示分离株为B亚型禽偏肺病毒,将该毒株命名为禽偏肺病毒SDWF株。     

B亚型禽偏肺病毒逆转录套式PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank发布的B亚型禽偏肺病毒Fusion(F)基因的保守序列设计2对引物,建立了一种适用于B亚型禽偏肺病毒的逆转录套式PCR检测方法.采用该方法对B亚型禽偏肺病毒山东分离株进行检测,可以特异性地扩增出415 bp的目的片段.此方法具有高度特异性和敏感性,以H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒作为模板进行扩增,结果均为阴性.经检测,该方法第1次PCR扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增敏感性比第1次高105倍.应用本方法对采自山东省不同地区的64份可疑临床病料进行检测,最终从64份疑似病料中检测出37份为阳性.结果表明,所建立的套式PCR检测方法具有特异、敏感、实用等优点,为B亚型禽偏肺病毒的快速诊断以及深入研究奠定了基础.     

1株B亚型禽偏肺病毒的分离与鉴定

从山东省多个地区的商品肉鸡养殖场采集64份疑似病料,通过RT—PCR方法检测出37份禽偏肺病毒阳性病料,以此作为病毒分离材料接种SPF鸡胚,盲传至第7代时鸡胚生长明显迟滞。取阳性尿囊液在CEF中培养,呈现禽偏肺病毒典型细胞病变（CPE）：细胞变圆、悬浮,有合胞体形成。将分离株接种于Veto细胞及DF-1细胞均出现类似病变。对分离株F基因进行测序,并与GenBank中发表的部分代表序列比较。结果显示,与B亚型禽偏肺病毒的核苷酸同源性最高,为97．4％～99．3％;与A亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性较低,为77．4％～78．1％;而与C亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性最低,为69．5％～69．7％。基因分型显示分离株为B亚型禽偏肺病毒,将该毒株命名为禽偏肺病毒SDWF株。     

B亚型禽偏肺病毒重组G蛋白间接ELISA方法的建立及应用

以纯化的B亚型禽偏肺病毒(aMPV)疫苗株(VIR-115 B)重组G蛋白作为包被抗原,对各项条件进行优化,确定判定标准,建立检测B亚型aMPV抗体的间接ELISA方法.将构建好的重组质粒转入Rosetta (DE3)感受态细胞进行诱导表达,获得重组G蛋白.利用亲和层析法对表达产物进行纯化,并用Western-blotting对表达产物进行鉴定.以纯化后的重组G蛋白作为诊断抗原,对ELISA反应条件进行优化,初步建立检测B亚型aMPV抗体的间接ELISA诊断方法.结果显示,成功表达并纯化了B亚型aMPV疫苗株(VIR-115 B)重组G蛋白,Westernblotting检测结果证明表达产物具有良好的反应原性.以重组G蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法.交叉试验结果表明重组G蛋白与新城疫、禽流感(H9N2)、传染性支气管炎和传染性法氏囊阳性血清均不发生交叉反应.该方法与法国IDEXX公司生产的aMPV抗体检测试剂盒符合率为96.0％.采用本试验建立的间接ELISA方法对山东省7个地区鸡场的1 139份鸡血清进行了检测,结果表明,山东省部分地区aMPV的抗体阳性率为37.05％.本试验建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,利用该方法初步证实山东省部分地区存在aMPV感染现象.这一研究为aMPV诊断试剂盒的研制奠定了基础,并为该病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段.