陕西杨凌某蛋鸡场禽戊型肝炎病毒的检测

2014年-2015年陕西杨凌地区部分商品蛋鸡场产蛋量下降了10%~40%,剖检部分鸡只发现肝脏肿大出血。为确诊该疫情的病因,从发病的6个蛋鸡场采集了337份血清和268份粪便,利用间接ELISA和套式RT-PCR分别对血清中的禽戊型肝炎病毒(HEV)抗体和粪便中的禽HEV RNA进行了实验室检测。ELISA检测结果发现,168份血清为禽HEV抗体阳性,阳性率为49.85%;套式RT-PCR检测结果发现,63份粪便为禽HEV RNA基因片段阳性,阳性率为23.51%。基因片段的序列同源性分析发现,杨凌地区的禽HEV分离株与国内的同源性为93.0%~99.2%;进化树分析表明,其与国内其他地区的分离株在同一进化分支上,同属禽HEV基因3型。     

副鸡禽杆菌单因子血清的制备与应用

利用副鸡禽杆菌的A、B和C3个血清型的参考菌株Hpg-8、CCM6075和Hpg-68分别制备相应的抗血清，然后对抗血清进行交叉吸收试验，得到A型、B型和C型3种单因子血清，不同血清型的单因子血清不与其他血清型菌株发生凝集。利用这3种单因子血清对临床上分离到的6株副鸡禽杆菌进行血清型的鉴定，结果表明6株地方分离株均为血清A型。     

广东地区鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及双重PCR检测方法的建立

对来自广东地区疑似鸭疫里默氏杆菌病的病鸭组织进行了病原菌的分离培养和生化鉴定,确定得到20株鸭疫里默氏杆菌,动物回归试验结果表明,分离的鸭疫里默氏杆菌具有很强的致病性.对这20株鸭疫里默氏杆菌进行的药敏试验表明,分离株已广泛产生耐药性.参照已经发表的2对引物以细菌全菌体为模板建立双重PCR方法,结果均能扩增出2条目的片段,经测序证实为鸭疫里默氏杆菌,而对鸭源大肠杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门菌和鸭源葡萄球菌的扩增结果均为阴性.说明建立的双重PCR方法能快速、准确的检测出鸭疫里默氏杆菌,并具有高度特异性,可用于鸭疫里默氏杆菌的快速鉴定和快速诊断.     

鸭疫里默氏杆菌中国分离株的外膜蛋白A基因的克隆与序列分析

为了对鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)中国分离株的外膜蛋白A(OmpA)基因的序列进行分析,根据GenBank中已发表的鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的外膜蛋白A(Om-pA)基因序列,在其高度保守区设计一对特异性引物,应用PCR技术,分别扩增从中国广东、福建和山东等地分离的8株鸭疫里默氏杆菌中国分离株的OmpA基因,克隆测序后与GenBank中已发表的26株鸭疫里默氏杆菌进行序列比较,结果表明:所有菌株的OmpA基因均为由1164个碱基组成的ORF,编码387个氨基酸组成的蛋白质,起始密码子均为ATG,终止密码子均为TAA,其核苷酸序列非常保守,同源性高达88.2%~100%,氨基酸同源性达到88.9%~100%。试验表明,OmpA基因具有种内相对保守性,其核苷酸与氨基酸同源性与鸭疫里默氏杆菌的血清型、分离时间和地点之间无必然联系。     

猪戊型肝炎病毒血清抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

由于猪戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)可跨种属感染人,因此,猪群中猪HEV感染的监测对于该病的防控和公共卫生都具有重要的意义。本试验旨在建立一种检测猪HEV抗体的间接ELISA方法,以原核表达纯化截短的猪HEV衣壳蛋白为包被抗原,优化条件,确定最佳试验条件,并分析该方法的敏感性、特异性、重复性,以及与商品化试剂盒的符合率,评价其临床应用价值。SDS-PAGE和Western blot结果证明抗原蛋白获得正确表达与纯化,并且具有良好的反应原性,可以作为后续建立ELISA方法的包被抗原。通过优化ELISA条件,最终确定抗原最佳包被量为200ng·孔-1,血清最佳稀释度为1∶200,包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(pH 9.6),封闭液为2.5%的脱脂奶粉,阴阳性判定的临界值为OD450nm≥0.296。该间接ELISA方法的特异性和敏感性良好,板内和板间变异系数均小于10%,与北京万泰商品化试剂盒符合率为91.2%。临床应用表明,该方法可应用于猪HEV感染猪后抗体消长以及临床猪血清抗体的检测。因此,本研究建立的猪HEV抗体间接ELISA检测方法具有较好的敏感性和特异性,准确率较高,该方法适用于临床猪血清样品的检测和猪HEV感染血清流行病学的调查。     

抗非洲猪瘟病毒NP419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是猪的一种高度传染性疾病，严重威胁全球养猪业的发展。本研究旨在筛选抗非洲猪瘟病毒(ASF virus, ASFV)NP419L蛋白的纳米抗体并对其在ASF抗体检测中的应用进行初步评价。大肠杆菌表达和Ni-NTA亲和层析纯化等技术表达纯化重组NP419L蛋白；将纯化的重组蛋白免疫双峰驼，5次免疫采集外周血淋巴细胞提取总RNA,经反转录、巢式PCR、酶切、连接和电转化等构建抗NP419L蛋白的噬菌体展示文库；利用噬菌体展示筛淘技术，经三轮筛淘获得抗NP419L蛋白的纳米抗体；构建纳米抗体与辣根过氧化物酶(HRP)融合蛋白的真核表达载体，转染HEK293T细胞，ELISA和间接免疫荧光(IFA)等鉴定融合蛋白的分泌表达及其与NP419L蛋白的结合；竞争ELISA初步评价获得的纳米抗体与HRP融合蛋白在ASF抗体检测中的应用。结果显示，成功制备了纯度较高的预期大小为48 ku的重组NP419L蛋白；构建获得了阳性率为89.5%,库容量为6×10⁸的噬菌体展示文库；筛淘获得了6株抗NP419L蛋白的纳米抗体；分泌表...     

我国鸡群禽戊型肝炎病毒RT-PCR检测及部分ORF2基因序列分析

为从核酸水平证实我国鸡群中禽戊型肝炎病毒(HEV)的存在,本实验从山东省某鸡场患有肝脾肿大综合征的病鸡中采集10份粪便和8份胆汁样品,利用RT-PCR方法检测其中禽HEV ORF2基因片段,并将阳性PCR产物克隆测序。结果显示:18份粪便和胆汁样品中,13份为禽HEV RNA阳性;其序列间的同源性为97%～99%,与GenBank中登录的参考序列同源性为76.6%～98.1%;进化树显示与欧洲地区的禽HEV在同一分支,属于禽HEV基因3型。禽HEV ORF2基因的检出为进一步了解禽HEV对我国家禽养殖业的危害以及在我国的流行情况奠定了基础。