芒果MiZAT10A和MiZAT10B功能分析

【目的】锌指蛋白（zinc finger protein,ZFP）在植物非生物胁迫应答中起重要的作用,研究两个锌指蛋白基因MiZAT10A和MiZAT10B转入拟南芥对盐、干旱、重金属以及外源激素等非生物胁迫的应答,为抗逆育种提供理论依据。【方法】利用在线软件PLACE和MEME分别对芒果MiZAT10A和MiZAT10B进行启动子顺式作用元件以及motif预测和分析,并利用TBtools软件和‘四季蜜芒’基因注释文件（GFF文件,未公开）绘制染色体定位图;通过实时荧光定量分析MiZAT10A和MiZAT10B的组织表达模式;构建芒果MiZAT10A和MiZAT10B超量表达载体,采用农杆菌花序浸染法转化模式植物拟南芥,观察并记录转基因拟南芥开花表型以及在盐、干旱、重金属以及外源激素脱落酸和赤霉素处理下的根生长情况。【结果】启动子顺式元件分析显示,两个基因的启动子区域都有许多光响应元件、激素响应元件和非生物胁迫响应元件。表达模式分析显示,MiZAT10A与MiZAT10B在芽和花中表达水平最高。MiZAT10A和MiZAT10B分别获得了9株和14株转基因拟南芥,开花表型分析显示,Mi...     

谷子转录因子SiNAC18通过ABA信号途径正向调控干旱条件下的种子萌发

【目的】谷子(Setaria italica L.)具有显著耐旱性。研究旨在通过反向遗传学方法分析并鉴定在干旱条件下影响植物萌发过程的重要调控因子,为研究作物干旱条件下种子萌发的调控机制创造条件。【方法】使用Clustal X 2.0和MEGA 5.05软件对谷子SiNAC18蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建系统进化树;利用real-time PCR方法检测SiNAC18在不同胁迫条件下的表达模式;通过瞬时转化的方法分析SiNAC18蛋白亚细胞定位;在拟南芥中过表达SiNAC18,分析SiNAC18的生物学功能;分析SiNAC18在转基因拟南芥中可能控制的下游基因。【结果】SiNAC18全长1 074 bp,编码由357个氨基酸组成的亲水性蛋白,分子量约为38.8 k D;系统进化树分析表明SiNAC18属于NAC转录因子家族第Ⅰ组的NAP亚组,与拟南芥基因At NAC29同源性最高;氨基酸序列比对结果显示,SiNAC18与其他物种包括水稻、拟南芥、大豆和玉米中同源性最高的NAC类转录因子蛋白的N端都具有A、B、C、D和E这5个保守结构域,蛋白C端具有高度多态性,证明SiNAC18的N端序列与其结合下游基因启动子元件相关;real-time PCR结果显示,SiNAC18在干旱(PEG)、ABA、高盐(Na Cl)及过氧化氢(H2O2)处理条件下的表达量明显上升;亚细胞定位结果表明SiNAC18蛋白定位于细胞核中;基因功能分析结果显示,在ABA和PEG胁迫处理下,SiNAC18转基因拟南芥与野生型种子的萌发率存在明显差异:在正常生长条件下,野生型拟南芥WT和SiNAC18转基因拟南芥的萌发率基本一致,在PEG浓度为10%和15%的MS培养基上,SiNAC18转基因拟南芥的萌发率显著高于WT。在2和5μmol·L-1 ABA处理条件下,转基因拟南芥的萌发率显著低于WT;下游基因表达分析结果显示,ABA信号途径相关基因At RD29A,脯氨酸合成相关基因At P5CR和At PRODH以及过氧化物酶基因At PRX34在SiNAC18转基因株系中的表达量高于WT中的表达量,表明SiNAC18通过调控这些下游基因影响转基因植物在干旱条件下的萌发率。【结论】谷子NAC类转录因子基因SiNAC18可能通过ABA信号途径、氧化胁迫调控等途径正向调控植物在干旱条件下的萌发过程。     

FaGST基因过量表达获得拟南芥转基因植株

【目的】探明FaGST基因的功能和分子调控机制,为其后期的抗性利用与研究提供科学依据。【方法】利用前期构建的pCAMBIA1300-35S空载体和pCAMBIA1300-35S-FaGST过表达载体,将其转化感受态(DH5α)细胞后导入农杆菌GV3101,利用花序侵染法转化拟南芥,通过潮霉素(Hyp)进行筛选、PCR鉴定,并利用实时荧光定量PCR检测其表达量。【结果】FaGST基因成功导入拟南芥中,获得6株空载体转基因拟南芥植株和8株转FaGST基因拟南芥植株;8株转基因拟南芥植株的FaGST基因表达量为1.31～2.06,较野生型拟南芥植株表达量（1.00）显著或极显著提高。【结论】成功获得拟南芥转基因纯合植株,FaGST基因在拟南芥植株中已过量表达。     

蕙兰Flowering locus T基因的克隆及其对开花的影响

【目的】 探讨CfFT基因在蕙兰成花中的作用。【方法】采用RT-PCR结合RACE技术从蕙兰(Cymbidium faberi)中克隆Flowering locus T（FT）同源基因CfFT。采用实时定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期CfFT进行表达分析。将该基因克隆到PBI121载体上导入烟草中,并对不同转基因烟草株系中的CfFT、NFL、NtFUL和NAP1基因进行实时定量RT-PCR分析。【结果】对蕙兰花芽分化不同时期的CfFT的表达分析表明,CfFT在花芽分化初期的表达量最高,之后随着花芽的成熟表达量逐渐降低。将CfFT导入烟草进行异源表达,转基因株系表现出明显的早花表型。对开花时间不一的转基因株系中的CfFT表达分析表明,其表达量与转基因烟草开花时间早晚成正比。进一步对这些株系内源的NFL、NAP1和NtFUL表达分析表明,NFL、NAP1和NtFUL基因的表达量与CfFT表达成正比,说明NFL、NAP1和NtFUL的表达受FT基因的上游调控。【结论】在烟草中异源表达蕙兰中的CfFT基因能促进烟草提前开花。     

棉花GhFAD2-1基因5’UTR内含子的克隆与序列分析

【目的】对棉花~(Δ12)-油酸去饱和酶基因Gh FAD2-1 5'UTR区的内含子进行克隆和序列分析,为研究Gh FAD2-1的表达调控奠定基础。【方法】利用5'RACE技术,克隆Gh FAD2-1的5'UTR序列,结合棉花基因组序列,克隆Gh FAD2-1 5'UTR内含子,并利用PLACE等生物信息学软件对其顺式作用原件进行分析。【结果】棉花A、D基因组的Gh FAD2-1 5'UTR中各含一内含子序列,全长分别为1 103 bp、1 111 bp;Gh FAD2-1成熟mRNA的5'UTR为77bp,转录的起点碱基为T;5'UTR内含子两个剪切位点分别AA-GG、CA-GC。该内含子包括一些典型的与光响应相关的作用元件,以及与激素和胁迫因素相关的应答元件等。【结论】克隆获得了棉花A、D基因组的Gh FAD2-1基因5'UTR内含子序列;明确其转录的起点碱基及5'UTR内含子的剪切位点,为进一步在分子水平上研究Gh FAD2-1功能及其表达调控规律,为植物的遗传改良奠定了基础。     

陆地棉叶片特异性表达启动子的克隆与表达分析

【目的】本研究旨在获得叶片特异表达启动子的全长并进行表达分析,为抗逆转基因育种提供重要顺式作用元件。【方法】通过基因芯片及RT-PCR筛选鉴定出1个高活性的棉花叶片特异性表达基因,通过电子克隆及PCR获得了该基因全长,并通过染色体步移法(Genome walking)经过3次步移成功获得翻译起始位点上游2kb左右的DNA片段,将其命名为叶片特异性表达启动子LSP(leaf specific promoter)。【结果】生物信息学分析表明,该序列含有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box及多个顺势作用元件。通过构建该启动子驱动GUS的植物表达载体p Ghlsp∷GUS,并经农杆菌花絮侵染法转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色观察,结果显示该基因主要在叶片中特异性表达,而根部以及茎部几乎不表达。【结论】LSP是一个全新的叶片特异性表达启动子,为研究外源基因在棉花叶片中的定位表达奠定基础。基因工程中利用此类启动子可以在改良棉花性状的同时减少对棉花生理方面的副作用,在棉花抗逆转基因育种方面有广泛的应用前景。     

拟南芥仅含START结构域亚家族基因特性与功能分析

【目的】分析拟南芥中仅含START结构域(the lipid/sterol-binding St AR-related lipid transfer protein domains)亚家族成员的启动子元件及表达特性,阐明启动子元件与表达特性的相互关系,为明确仅含START结构域亚家族的生物学功能,解析植物生长发育机理、更好地促控植物生长提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法分析仅含START结构域亚家族6个成员的亲缘关系及各自启动子区所包含的所有元件,对启动子元件的功能进行分析和分类;利用real-time PCR方法研究亚家族成员的表达特性;用突变体分析确认基因的功能;分析通过启动子元件分析预测的基因功能与通过突变体分析确认的基因功能间的相关性,为基因的功能和作用机制分析提供科研思路和方法。【结果】生物信息学分析表明,拟南芥中仅含START结构域亚家族成员共6个,分为3个分支,每个分支一对基因,每一对基因中均有一个基因的启动子中含有高转录水平元件5′UTR Py-rich stretch,6个亚家族成员的启动子区均含有多个光、激素和逆境响应元件,也存在各自特异的响应元件;用real-time PCR分析基因的表达量,结果与生物信息学预测结果一致:At3g13062的表达量明显高于同分支的At1g55960,At3g23080的表达量明显高于同分支的At4g14500,At1g64720的表达量明显高于同分支的At5g54170。组织定位分析表明亚家族成员有特异的时空表达特性:At3g13062和At1g55960在幼苗期就有明显表达,但At3g13062主要在子叶、下胚轴和根中表达,而At1g55960主要在根中表达量较多;在成苗期拟南芥中,At3g13062主要在叶片中表达,在根中表达量较少;而At1g55960在成苗期拟南芥的叶片和根系的表达量均较多;At3g23080和At4g14500在幼苗期表达量较少,而在成苗期表达量增加,At3g23080主要分布于莲座叶中,At4g14500主要分布于莲座叶叶柄部。上述结果表明仅含START结构域亚家族成员可能在拟南芥不同时期和不同的部位分别行使着功能。利用生物信息学对启动子元件分析发现,各个基因均具有胚乳特意表达的Skn-1 motif元件,暗示着该家族基因可能参与调控胚乳的发育,进而影响种子的活力和萌发;通过对At3g23080和At4g14500的T-DNA插入突变体种子的分析表明,At3g23080和At4g14500表达量下降均会导致种子活力和萌发率的下降,这与生物信息学预测结果一致。【结论】拟南芥中仅含START结构域的亚家族有6个成员;6个亚家族成员可能在光、激素和逆境调控的发育过程中具有重要的作用;含START结构域的亚家族6个成员虽然同源关系较近,但具有各自的时空表达特性,在拟南芥的不同组织和不同发育时期执行着各自的功能。基因启动子元件与基因功能有直接关系,启动子区具有胚乳特意表达Skn-1 motif元件的At3g23080和At4g14500表达量下降均会导致种子活力和萌发率下降。     

棉花矮化突变体AS98差异基因表达cDNA-AFLP分析

【目的】为了探究矮化突变体AS98发生变异的分子生物学机制,【方法】本研究利用正常陆地棉品种LHF10W99(简称LHF)与AS98杂交后代分离出的正常表现型植株和极端矮化表现型植株,在现蕾期提取2种株型的茎尖、茎和根的RNA,利用cDNA-AFLP技术分析2种植株茎尖的表达差异。【结果】筛选到差异表达的片段32条,对这32条片段进行克隆测序,利用生物信息学进行分析发现其中一条(HD61)与拟南芥的阿拉伯半乳聚糖蛋白的同源性较高。用棉花的阿拉伯半乳聚糖蛋白(Gh AGP)的序列设计引物,用RT-PCR方法检验阿拉伯半乳聚糖蛋白在2类植株的茎尖、茎和根等组织上的表达量,结果表明,Gh AGP基因在突变型和正常型材料的茎、根上的表达量基本相同,但是在茎尖上却表现出明显的差异,突变型茎尖上的表达量显著低于正常型茎尖的表达量,说明Gh AGP可能参与棉花茎尖细胞的伸长生长过程。【结论】AS98的半乳糖代谢的改变可能与赤霉素(GA)合成中基因发生突变有关,不能合成正常具有生物活性的GA,使得阿拉伯半乳聚糖蛋白等基因在AS98茎尖的表达减少甚至缺乏。     

玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆玉米Zea mays淀粉合成酶SSⅡa启动子,并分析其功能,为进一步研究和应用SSⅡa启动子奠定基础。【方法】通过NCBI上公布的玉米基因组序列,在网站Maize GDB上BLAST查找到SSⅡa 5'侧翼序列,利用PCR方法从玉米B73中克隆SSⅡa启动子;通过Plant Care在线分析启动子顺式作用元件,用特异性引物分别克隆出长度为1 407、867、633、483和365 bp的片段,与植物表达载体p CAMBIA3301连接,构建5种5'缺失体的植物表达载体,命名为P1、P2、P3、P4和P5。用农杆菌介导法转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得转基因拟南芥。【结果】以玉米B73基因组DNA为模板,用特异性引物SSⅡa F/SSⅡaR进行扩增,得到2 526 bp序列;除草剂筛选的阳性拟南芥植株PCR验证均检测出gus基因;GUS组织化学分析表明,5种类型启动子构建的表达载体在成熟期叶片、果荚中均显蓝色;gus基因定量分析表明,成熟期5种转基因拟南芥叶片中,gus基因表达量P1最高,其他基本一致;种子中gus基因表达量P1和P2相近,且高于P3、P4和P5。【结论】成功克隆玉米SSⅡa启动子;构建的5种SSⅡa启动子缺失体表达载体在转基因拟南芥中均具有活性,长度为1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的启动子具有胚乳特异性。     

玉米MATE基因在植物生长发育和下胚轴伸长中的调控作用

【目的】研究玉米多药及有毒化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)基因ZmMATE884(GRMZM2G423884)在植物生长发育阶段的功能。【方法】以玉米全基因组DNA为模板克隆玉米MATE蛋白家族基因ZmMATE884,通过蛋白同源比对,预测其可能的跨膜结构域,并通过定量RT-PCR分析该基因的表达模式;构建ZmMATE884融合荧光蛋白瞬时表达载体,转化拟南芥叶肉细胞原生质体,进行亚细胞定位分析;通过农杆菌侵染技术,构建ZmMATE884基因的拟南芥转基因过表达系,观察表型;将ZmMATE884基因的拟南芥转基因过表达系与野生型种子分别种植于含质量分数1%蔗糖和不含糖的1/2 MS固体培养基上,分别黑暗培养6d和光照培养7d后,观测统计下胚轴的伸长情况。【结果】ZmMATE884基因在玉米根、上枝叶、下枝叶和胚中有较高表达;ZmMATE884蛋白部分定位于高尔基体/内体上;ZmMATE884基因的拟南芥过表达转基因植株表现为莲座叶发生速率加快且开花提前;在无糖和含质量分数1%蔗糖的1/2 MS固体培养基上黑暗生长6d及光下生长7d后,ZmMATE884基因的拟南芥转基因过表达系下胚轴明显短于野生型。【结论】玉米ZmMATE884基因参与了植物生长发育的调控,可加快莲座叶发生,促使植物提前开花,同时还参与下胚轴伸长的负调控。     

外源GA_3影响牡丹花芽DNA甲基化水平和相关酶基因的表达分析

【目的】外施赤霉素(GA)是生产上辅助解除牡丹花芽休眠进行反季节盆花生产的常用手段,赤霉素如何发挥作用解除牡丹花芽休眠是未解的科学问题,本文旨在明确赤霉素是否通过表观遗传方式参与内休眠调控。【方法】从DNA甲基化入手,以4年生‘鲁菏红’为材料,500 mg·L~(-1)的GA_3处理花芽,并在处理后0.5、1、3和5 d后取健壮顶芽,CTAB法提取花芽DNA,HPLC技术测定GA_3处理后牡丹花芽DNA甲基化水平的变化;利用转录组分析结合RACE技术得到牡丹3种DNA甲基转移酶基因PsCMT、PsMET、PsDRM和DNA去甲基化酶基因PsROS1的序列,生物信息学方法比对基因序列并分析可能的结构域,MEGA 5.0构建系统发育树;以Actin为内参,利用q PCR方法分析其组织表达特性和对GA_3的响应。【结果】3种DNA甲基转移酶基因(Dnmts)的开放阅读框长短不一,PsCMT、PsMET、PsDRM开放阅读框长度分别为1 118、1 056、2 175 bp,编码的氨基酸数目分别为372、351、724。3种DNA甲基转移酶均有甲基转移酶结构域。而DNA去甲基化酶基因PsROS1的序列较长,开放阅读框为6 636 bp,编码2 211个氨基酸。PsROS1上存在保守的DNA糖基化结构域。系统发育分析表明,牡丹中的PsCMT和PsDRM蛋白与葡萄的Vv CMT2蛋白亲缘关系最近,PsMET和PsROS1与大部分木本植物聚为一支,与烟草等距离较远。PsCMT、PsMET、PsDRM在牡丹初花期的各个组织(根、茎、叶、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮)中均有表达,其中在牡丹根中表达量较高,而PsROS1在心皮中表达量最高。GA_3处理5 d,牡丹花芽迅速萌动,60 d时萌动率为97.5%,成花率为92.5%;对照20 d时才有少量花芽萌动,至60 d时萌动率仅为23.1%。GA_3显著降低了牡丹花芽DNA甲基化水平(P0.01),从处理前的38.9%降至处理5 d时的28.7%;GA_3处理提高了PsCMT和PsROS1的表达水平,降低了PsDRM的表达水平,而PsMET的表达水平差异不显著。【结论】GA_3处理通过诱导PsROS1表达、抑制PsDRM表达导致了DNA低甲基化,进而促进了牡丹休眠解除,可能是赤霉素发挥作用的一种重要方式。     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁-T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照（病情指数36.81-46.24）显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。     

利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量

【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达,获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质,探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列,通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4,利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚,获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量,并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测,以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验,检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条（Gp4和Gp5）,测序结果表明该片段大小为349 bp,聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%,与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%,确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207,反向重复序列用i18 和 iv2 intron连接,构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体 pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚,结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证,获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T₂/T₃转基因大麦基因组。随机选取6个T₃转基因大麦株系,半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照,20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%-55.19%,而且在各时期中也最低。利用随机选取的T₁和T₃籽粒进行蛋白质含量测定表明,8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低,SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比,转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低,其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显,平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验,结果表明,高氮肥水平HN₂及HN₃处理,该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照;施以等量高氮肥时,伴随氮肥后移（HN₂到HN₃）,该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低,电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达,降低B-醇溶蛋白含量,高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。     

枇杷叶片发育基因EjGRF5与启动子克隆及其在不同倍性枇杷中的表达

【目的】克隆并解析枇杷（Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.）中参与调控叶片生长发育的EjGRF5及其启动子序列的结构特征,研究其在不同倍性枇杷中的表达特性,为进一步研究该基因调控不同倍性枇杷叶片生长势差异的机理奠定基础。【方法】从转录组测序数据中挖掘枇杷EjGRF5的参考序列,以此序列设计引物,并以‘龙泉1号’四倍体枇杷基因组DNA为模板扩增EjGRF5全长,参照EjGRF5参考序列获得其CDS序列。利用Bioedit7.2及SignalP4.1对EjGRF5的CDS序列及其蛋白的理化性质进行分析;采用Mega7.0软件构建EjGRF5和其他物种GRF5的系统进化树;采用LocTree3及SoftBerry ProtComp9.0在线软件对EjGRF5蛋白进行亚细胞定位预测;采用染色体步移的方法克隆EjGRF5的启动子序列,并利用PlantCARE在线软件对克隆得到的EjGRF5启动子序列进行生物信息学分析;采用RT-PCR技术对EjGRF5在三倍体枇杷及其亲本（4x、2x）中的表达差异进行初步分析。【结果】将测序结果与转录组测序的参考序列进行比对发现,EjGRF5全长为1 386 bp,含有3个外显子,2个内含子,内含子全长399 bp,CDS全长987 bp。进化树分析表明,枇杷EjGRF5与蔷薇科的其他植物高度同源,且与白梨的亲缘关系最近。亚细胞定位预测结果显示,枇杷EjGRF5蛋白定位于细胞核中。启动子分析显示,EjGRF5启动子区域含有多个顺势作用元件,包括脱落酸、乙烯、高温、厌氧诱导、赤霉素和光响应元件,并且光响应元件多达11个。qRT-PCR结果显示,除F₁代A-6和B-3外,其余三倍体子代EjGRF5表达量相对于中间亲本值（MPV）都发生了不同程度的上调,其中A-3的表达量是其MPV的20倍,A-5表达量是其MPV的18倍左右。【结论】获得了与枇杷叶片生长发育相关的EjGRF5、CDS序列及其启动子序列,EjGRF5在三倍体枇杷叶片中的表达呈现出上调趋势。     

黄瓜白粉病抗性基因定位及候选基因分析

【目的】通过对黄瓜白粉病抗性基因的精细定位,明确抗性基因的候选区段,为进一步克隆基因及解析基因功能奠定基础。【方法】本研究选用高抗白粉病资源(自交系‘74’)和感白粉病资源(自交系‘80’)配制杂交组合,构建F_1、F_2群体,利用单囊壳白粉菌鉴定亲本及群体白粉病抗性并进行遗传分析;采用BSA-seq的方法对黄瓜白粉病抗性基因进行初步定位,在此基础上在候选区段开发分子标记,进一步精细定位白粉病抗性基因。【结果】分离群体单株表型鉴定结果表明,自交系74的抗性是由不完全隐性基因控制的。BSA-seq技术初步将抗性基因定位于5号染色体15—25 Mb位置,命名为PM 74。最终,利用分子标记将抗性基因定位于SSR15321和SSR07531之间,遗传距离为3.06 c M,物理距离为238 444 bp,可解释41.95%的表型变异。生物信息学分析表明在候选区段内包含有17个候选基因,其中Cucsa.275630为TIR-NBS-LRR类基因。【结论】本研究将黄瓜白粉病抗性基因精细定位到约238 kb的候选区段内,区段内包含有一个TIR-NBS-LRR基因,该基因将是今后研究的重点候选基因。     

飞蝗几丁质酶5-1抗体制备及表达特性分析

【目的】通过制备飞蝗（Locusta migratoria）几丁质酶5-1（LmCht5-1）的多克隆抗体,建立飞蝗体内LmCht5-1蛋白水平检测方法,分析LmCht5-1在4龄飞蝗的表达特性及组织定位。【方法】采用MEGA 软件对LmCht5-1和LmCht5-2氨基酸序列进行比对,利用Expression网站对LmCht5-1氨基酸序列进行抗原表位预测分析,获得LmCht5-1抗原结构区域;以飞蝗cDNA为模板,通过PCR扩增LmCht5-1的抗原片段;同时通过酶切连接构建含有鸡血清白蛋白OVA的载体pET32a-OVA;然后通过酶切连接将LmCht5-1插入到pET32a-OVA载体构建pET32a-OVA-LmCht5-1;将pET32a-OVA-LmCht5-1转入表达菌株BL21（DE3）中,IPTG诱导表达重组蛋白OVA-LmCht5-1;利用Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA方法检测抗体效价;利用Western blot检测抗体特异性。提取4龄飞蝗不同日龄表皮,采用Western blot分析LmCht5-1蛋白表达模式。对4龄飞蝗注射dsLmCht5-1,检测蛋白水平LmCht5-1表达量,并通过免疫组化方法对LmCht5-1进行定位及功能分析。【结果】通过LmCht5-1和LmCht5-2序列比对和抗原表位预测分析,获得LmCht5-1的471-533AA可作为抗原区域;通过酶切连接分别获得pET32a-OVA和pET32a-OVA-LmCht5-1。经诱导表达和纯化后获得重组蛋白OVA-LmCht5-1,分子量为71.34 kD;免疫后制备多克隆抗体OVA-LmCht5-1,ELISA检测效价为1﹕102 400。多克隆抗体OVA-LmCht5-1用于Western blot检测时可特异性识别LmCht5-1,与LmCht5-2蛋白无交叉反应。利用Western blot方法检测4龄若虫各日龄表皮中LmCht5-1蛋白的表达,发现LmCht5-1蛋白随发育日龄其表达量逐渐增加,在蜕皮当天达到峰值,蜕皮后快速降至最低点。对飞蝗若虫N4D2注射dsLmCht5-1,检测到在N4D5时,LmCht5-1的转录水平和蛋白水平均被显著抑制,抑制率分别为70.0%和73.6%。选取注射dsLmCht5-1和dsGFP的4龄飞蝗表皮,进行免疫组化实验显示LmCht5-1定位于表皮细胞和旧表皮中,其功能失活引起旧表皮中几丁质不降解。【结论】获得飞蝗LmCht5-1多克隆抗体可特异性识别LmCht5-1,可用于Western blot和免疫组化检测。明确LmCht5-1在飞蝗4龄若虫蜕皮当天表达最高,定位于表皮细胞和旧表皮中。dsLmCht5-1可减少表皮细胞和旧表皮中LmCht5-1的表达,阻碍旧表皮中几丁质的降解。     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4启动子结构与活性分析

【目的】克隆GmPAP4启动子(PAP4-pro),并分析其表达特性,为进一步研究其作用机制奠定基础。【方法】依据GmPAP4 c DNA序列(Gen Bank No.HQ162477),通过比对大豆参考基因组,设计特异引物,克隆GmPAP4启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测该启动子相关调控元件。构建GmPAP4启动子驱动GUS表达载体(PAP4-pro-GUS)并转化根癌农杆菌GV3101;通过Floral dip法将PAP4-pro-GUS转化拟南芥,利用卡那霉素(Kan)抗性筛选和特异引物的PCR鉴定,最终获得T3转基因拟南芥。通过对T_3转基因拟南芥不同组织GUS染色,分析启动子的组织表达特性,将T3转基因拟南芥通过适磷和植酸磷处理,20 d后,取其根部进行GUS活性和表达分析,研究启动子对不同磷环境的响应。【结果】克隆了GmPAP4上游启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测显示,GmPAP4启动子除含有启动子核心的调控元件外,还含有(1)组织特异调控元件:as1(根系特异表达调控元件)和Skn-1_motif(胚乳特异表达调控元件);(2)应答元件:TC-rich repeats(逆境胁迫反应调控元件)和Box-W3(真菌应答相关调控元件);(3)结合位点:MBS(MYB转录因子的结合位点)等。不同组织GUS染色结果显示,转基因拟南芥整个根系GUS染色较深,茎、叶中仅微管组织有较明显GUS染色,花瓣微管组织中也能观察到微弱GUS染色。定量PCR结果显示,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS表达比适磷处理提高了1.3倍(P0.05);同时GUS活性测定显示,与适磷处理相比,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS活性提高了1.9倍(P0.05)。【结论】获得大豆GmPAP4启动子,通过不同组织GUS染色和不同磷环境GUS表达分析显示该启动子主要在根部且受低磷信号诱导表达,为诱导型启动子。     

棉铃虫磷脂酰乙醇胺结合蛋白的克隆及表达分析

【目的】克隆获得棉铃虫（Helicoverpa armigera）磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的cDNA序列,分析HaPEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内HaPEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据。【方法】利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到HaPEBP的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HaPEBP的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白。最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中HaPEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内HaPEBP的变化规律。【结果】获得的HaPEBP cDNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 kD和5.93。氨基酸序列分析表明HaPEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个β折叠片组成的胞质单体蛋白。将BL21(DE3)-pET32a-HaPEBP重组菌用1 mmol·L^-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 kD的融合蛋白His-HaPEBP能以可溶的形式存在于重组菌中。按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L^-1的咪唑洗涤两次后得到约40 kD的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致。将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μl^-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应。HaPEBP在棉铃虫幼虫的1-6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高。该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高。不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内HaPEBP的表达量均有所降低;低浓度(2.5和5 mg·g^-1)在6 h就能降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长逐渐增加;而高浓度(10和15 mg·g^-1)在12 h才会降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长先下降后上升。【结论】克隆分析了HaPEBP,利用大肠杆菌系统表达出可溶的融合蛋白His-HaPEBP,并通过镍柱-咪唑纯化法得到了高纯度的融合蛋白,时空表达分析显示HaPEBP在棉铃虫6龄幼虫和脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理6龄幼虫后中肠内HaPEBP的表达量显著降低。     

橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析

【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶,获得橡胶草FPS基因并转化野生橡胶草,为研究FPS基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析。对橡胶草和其他18种不同高等植物的FPS氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取橡胶草不同组织：根、叶柄、叶、花梗、花和种子RNA,对FPS基因进行组织特异性表达分析,并对不同生长时期的橡胶草FPS表达量进行比较,分析橡胶草生长过程中FPS的调节作用。将该基因在野生型橡胶草中过表达,对得到的转基因和野生型植株FPS相对表达水平进行分析,比较转基因和野生型植株橡胶含量的变化。碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶,测定橡胶含量。【结果】获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,命名为TKFPS（GenBank登录号 KJ558350.1）。序列分析表明该基因包含1个1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为39.35 kD,理论等电点（pI）为5.41,平均疏水性为-0.242。多序列比对结果表明,橡胶草FPS氨基酸序列含有高等植物FPS基因的5个保守结构域,系统发育分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,TKFPS 蛋白无跨膜区域,可能定位于细胞质中发挥功能。组织特异性分析结果表明TKFPS在橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,根次之,在花中表达量最低。重组子pCAMBIA2300-35S-TKFPS经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘,得到6株转基因植株。实时荧光定量PCR检测发现,与野生型相比,转基因株系FPS的相对表达量水平明显升高,6株转基因株系TKFPS表达量平均约是野生型的2.8倍。橡胶含量测定结果表明6株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了3.92%。【结论】成功从橡胶草中克隆获得TKFPS,并转化野生橡胶草得到转TKFPS的高产橡胶草株系,FPS在橡胶草产胶过程中发挥重要功能。