非洲猪瘟病毒TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法建立

为建立一种快速、准确的非洲猪瘟病毒(ASFV)分子检测方法,以2018年8月分离的SY18毒株P72基因序列(GenBank登录号:MH713612.1)为参考毒株,人工合成质粒标准品,命名为pcDNA3-P72,基于该毒株P72基因序列,在1627~1876 bp处设计一对特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系及条件,本研究成功建立了基于P72基因的TaqMan探针qPCR方法,并与OIE的特异性引物和TaqMan探针进行灵敏度、稳定性和特异性比较.结果显示:本研究建立的qPCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R^2值可达到0.9932,灵敏性最低能检测到10 copies/μL,与OIE引物扩增灵敏度相当,比普通PCR方法高100倍.该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%.这一方法为我国非洲猪瘟疫情的快速确诊提供了必要的分子诊断工具.     

猪细小病毒7型荧光定量PCR检测方法的建立与应用

猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV。目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针。经过各反应条件的优化,初步建立了一种便捷、灵敏、能够快速准确检测PPV7的荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、稳定性以及与SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的符合率进行检测与对比。结果显示,该方法除对PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及PPV1核酸均无交叉反应,特异性较强。该方法对重组质粒标准品检测限为1.76拷贝/μL,而常规PCR方法检测限为1.76×10²拷贝/μL,表明本研究建立的方法敏感性较高。该方法对不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验变异系数均小于1.7%,重复性较好。利用本研究建立的qPCR方法和SYBR Green Ⅰ qPCR方法对采自福建地区的150份样品进行检测,结果显示,两种检...     

非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法的建立

建立一种具有高灵敏度的检测非洲猪瘟病毒的微滴数字PCR方法,为非洲猪瘟的快速诊断和流行病学研究提供技术支持。在《OIE陆生动物诊断与疫苗手册》中提供的qPCR检测方法的基础上,建立了非洲猪瘟病毒微滴数字PCR方法,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评估。结果显示,该方法的最低检测限可达0.8copies/μL,敏感性高于qPCR方法,不与猪常见的6种病毒发生交叉反应,而且重复性较好。采用建立的微滴数字PCR和OIE的qPCR方法分别对78份临床病料进行非洲猪瘟病毒的检测,结果显示2种方法的符合率为100%。本研究建立的微滴数字PCR方法具有理想的敏感性和特异性,适用于临床上非洲猪瘟病毒的检测。     

猪源牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种荧光定量PCR检测方法,用于猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDVs)检测,同时能鉴别诊断猪瘟病毒(CSFV).根据BVDVs与CSFV 5 '-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDVs 5′-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线.以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测.结果显示,该方法检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性;最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20％～0.95％;应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7％.本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDVs、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测.     

F亚群禽白血病病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测F亚群禽白血病病毒(ALV-F)的SYBR Green I荧光定量PCR方法,本研究以ALV-F分离株FGD1803基因组为模板,PCR扩增其env基因,构建重组质粒pMD18-T-F作为标准品。利用该重组质粒建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法(qPCR)的标准曲线,并经反应条件优化建立了检测ALV-F的qPCR方法。建立的标准曲线结果显示,重组质粒标准品的拷贝数与Ct值呈良好的线性关系,R2为0.993,扩增效率为1.03。该方法各反应条件的优化结果为10μmol/L上下游引物各0.5μL,退火温度为55℃。特异性试验结果显示,该方法仅能特异性检测ALV-F,而对ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K、ALV-E、网状内皮增生病病毒、马立克氏病病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、鸡支气管炎病毒等禽源病毒无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的最低检测限为1.16×102拷贝/μL,敏感性是常规PCR方法的100倍;以3个不同浓度重组质粒标准品为模板进行重复性试验,结果显示批内和批间重复性试验变异系数均小于5%;利用该方法与病毒培养方法分别检测30份七彩山鸡血浆样品(21份ALV阳性,9份阴性)的细胞培养物,结果显示该qPCR方法的阳性检出率为33.3%(10/30),常规PCR方法的阳性检出率为20.0%(6/30),病毒分离方法的阳性检出率为13.3%(4/30),该qPCR方法与病毒分离方法的符合率为80.0%。本研究在国内首次建立了用于ALV-F检测的qPCR方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以用于临床样品的检测。为该病毒的检测提供了技术支撑。     

非洲猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

建立一种TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)保守结构蛋白P72基因的检测。参照GenBank登录的ASFV P72相关基因序列,设计合成1对特异性引物与1个TaqMan探针,通过对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ASFV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,对该方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,该方法能有效扩增1.0×10~0～1.0×10~9拷贝/μL ASFV-P72标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0×10~0拷贝;对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%。结果表明,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于临床样本中ASFV的检测,从而更好地对ASF疫情进行监测和诊断。     

两种荧光定量PCR方法检测猪瘟病毒的比较及应用

根据猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）5端非编码区保守区域,设计猪瘟病毒特异性的引物和探针,建立了基于SYBR Green和TaqMan探针的两种荧光定量PCR检测方法。灵敏性和特异性试验结果表明,两种方法能够特异性地检测出不同型的猪瘟病毒,而对同属的牛病毒性腹泻病病毒以及其它一些主要猪病病原检测结果均为阴性。两种方法对猪瘟病毒C株的检测下限均为101TCID50,均高于常规的套式PCR。用携带该基因片段的重组质粒为模板进行检测,SYBR Green方法的检测下限为3×100copies,比TaqMan探针方法更加灵敏（3×101copies）。应用建立的SYBR Green方法对2009年采集于浙江地区不同猪场的20份病猪样品进行CSFV检测,有8份样品为阳性,与套式PCR方法检测结果一致。进一步应用SYBR Green方法对不同感染阶段细胞内病毒RNA复制水平进行检测,与病毒滴度的结果基本一致。因此,本研究建立的SYBRGreen荧光定量PCR检测方法能够应用于组织和培养细胞中猪瘟病毒的检测。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测技术的研究与评价

根据非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）K205R基因序列设计合成引物及TaqMan探针,通过优化引物浓度、退火温度和Mg²⁺浓度,建立基于K205R基因的ASFV实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）检测方法。对在猪肝脏组织DNA中掺入重组质粒制备的模拟样品进行扩增来确定所建方法的实际检测效率,并将OIE推荐的基于p72的qPCR调整后作为评价该方法检测效果的对照。试验结果表明,基于K205R基因的检测方法在检测模拟样品时扩增效率要优于基于p72的方法,而且敏感性和特异性强,适用于非洲猪瘟的快速检测、监测。     

可视化猪瘟病毒基因芯片鉴别检测方法的建立

为建立一种能够快速鉴别猪瘟病毒野毒和疫苗弱毒株的临床检测方法,本实验针对猪瘟病毒野毒株及疫苗弱毒株分别设计了特异性鉴别引物及探针,利用RT-PCR方法特异性扩增目的基因后进行芯片杂交反应并显色,直观判定检测结果,经反应条件优化建立了一种鉴别检测猪瘟病毒的基因芯片方法,并对该方法的特异性、敏感性及重复性进行了试验。结果显示,该芯片检测方法仅能鉴别检测出猪瘟病毒野毒株与疫苗弱毒株,不能检测猪的其他12种主要传染病病原,特异性较强。对猪瘟病毒野毒株和疫苗弱毒株重组质粒标准品的最低检出限分别为6.98拷贝/μL和6.92×10~1拷贝/μL,敏感性较高。选择不同批次基因芯片对同一质粒标准品的检测结果均为阳性,重复性良好。利用该方法检测177份临床样本,结果与国标猪瘟病毒RT-nPCR检测方法(GB/T26875-2018)相比较,总体符合率为99.43%(176/177)。可视化猪瘟病毒鉴别诊断基因芯片方法可在2 h内完成对猪瘟野毒感染和疫苗免疫的临床样本的鉴别检测,且检测结果可用肉眼直观判定,在基层猪瘟流行病学监测及我国猪瘟的防控和净化方面具有良好的应用前景。     

禽流感DNA疫苗重组质粒组织分布的实时荧光定量PCR方法建立

为研究禽流感病毒(AIV)DNA疫苗重组质粒在组织中的分布情况,本研究以AIV DNA疫苗pCAGGoptiHA 5HA基因为检测对象,分别建立检测AIV DNA疫苗重组质粒的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法和TaqMan MGB实时定量PCR方法。经优化比较两种方法的特异性、敏感性、重复性和污染率。结果表明,两种方法的标准曲线线性关系均较好,相关系数均达到0.999;最低检测量为42 copies,特异性强;探针法的重复性优于染料法,污染率低于染料法,因此采用TaqMan MGB实时定量PCR方法检测AIV DNA疫苗重组质粒组织分布情况。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与非典型瘟病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立同时快速简便地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与非典型瘟病毒(APPV)两种病毒的方法,本研究根据GenBank中登录的PRRSV、APPV的基因序列,选取PRRSV的ORF2基因和APPV的NS2基因分别设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测PRRSV与APPV的双重RT-PCR方法。利用该方法对PRRSV、APPV重组质粒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒的cDNA和阴性对照进行检测,结果显示除PRRSV和APPV重组质粒扩增结果为阳性外,其余均为阴性,表明其特异性良好;该方法对APPV和PRRSV质粒标准品的最低检出量分别为2.17×10~4拷贝/μL、3.13×10~3拷贝/μL,敏感性较高;同时批间和批内重复性试验表明该方法重复性好。利用该方法对四川地区临床73份疑似仔猪颤抖病与猪繁殖与呼吸综合征病的病料样品进行检测,结果与单一RT-PCR的检测符合率为100%。本研究建立的双重RT-PCR方法具有良好的实用性,可用于临床样品的检测,对临床早期诊断具有重要意义。     

猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人工感染CSFV后不同时期猪血浆中CSFV的载量。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,R²=0.999;敏感性高,最低检测限为1×10¹拷贝/μL;特异性强,与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%。人工感染CSFV后第7天猪血浆中CSFV载量达到峰值,之后逐渐降低。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、重复性好等优点,为CSFV的定量分析及临床诊断奠定基础。     

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

为实现对伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRV gD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数（R²）分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。     

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数(R2)分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了研究检测非洲猪瘟病毒的方法,试验采用GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列设计了1对特异性引物和探针,并使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法.结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性.     

猪蓝耳病与葡萄球菌病混合感染的诊断

为确诊某养猪场死亡病例的病因,采集病死猪内脏组织进行细菌分离鉴定和猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪蓝耳病病毒PCR检测。结果:(1)送检猪肝脏样本分离培养出呈金黄色的菌落,染色镜检可见菌体呈葡萄串状排列的革兰氏阳性球菌,经生化试验鉴定为金黄色葡萄球菌;(2)送检猪组织样本检出猪蓝耳病病毒特异性DNA片段,未检出猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒特异性DNA片段。综合诊断为猪蓝耳病病毒与金黄色葡萄球菌混合感染。     

猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列,设计了一对特异性引物和探针,使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法。结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性。     

非洲猪瘟病毒K196R基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒定量检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)早期表达基因K196R的基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针浓度,建立了快速检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法选择的引物具有高度灵敏性和特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系(R~2=0.998),对ASFV核酸最低检测下限为1.3拷贝,且与猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应。本研究建立的K196R基因实时荧光定量PCR检测方法为非洲猪瘟疫情提供了一种新型、灵敏和特异的早期检测方法。     

基于E184L基因的非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种高度接触性传染病。由于ASFV的感染机制极为复杂,基因型多,至今尚无有效疫苗用于防控,防止该病暴发主要依赖于早期快速诊断和控制。为建立一种高效快速、特异的ASFV检测方法,根据ASFV的E184L基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,建立了检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该方法设计的引物具有高度特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数为0.992,对ASFV核酸最低检测限为1.51拷贝,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等不存在交叉反应。建立的基于ASFV E184L基因实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异地对ASFV核酸进行定量分析,丰富了ASFV的检测方法。