猪源牛病毒性腹泻病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中BVDV-1、BVDV-2、CSFV及新出现瘟病毒的基因序列,设计2对特异引物,建立了能鉴别诊断BVDV与CSFV的Nested-PCR检测方法;确定其方法的特异性、敏感性、稳定性。建立的Nested-PCR能从BVDV标准毒株、猪源BVDV毒株中扩增198bp特异性片段,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性。结果表明,该方法具有较好特异性;其敏感性可检测到0.195fg RNA模板量;经重复性试验表明该方法具有良好稳定性。初步应用检测表明,猪BVDV阳性率较高,达36.0%;牛血清及其制品、猪瘟活疫苗BVDV污染严重。本试验建立的Nested-PCR具有敏感、特异和稳定等特点,可用于临床诊断和流行病学调查。     

传染性法氏囊病诊断技术研究进展

传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒引起鸡的一种高度接触性传染病,发病迅速,危害较大。本文对鸡传染性法氏囊病的流行病学、临床症状与病理变化、病原的分离诊断、免疫诊断和分子诊断等技术进行了综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4/ORF5基因区间的反向遗传操作:插入外源序列特性研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF4/ORF5基因间隔区有10个核苷酸(nucleotide,nt),为了探索ORF4/ORF5基因间隔区作为外源基因插入靶点的可行性,本研究通过突变PCR技术,获得一系列ORF4/ORF5间在不同位置插入不同碱基数及特定序列的突变体,随后进行了病毒拯救和复制分析。结果表明,在ORF4/5的10 nts间隔序列之前至少可插入13 nts;在间隔序列之后只能允许3 nts的插入;间隔序列之间能允许至少18 nts的插入,但允许插入的序列具有特异性,由此,暗示ORF4/5允许插入的外源序列与插入位置有关。本研究获得的诸多突变病毒为进一步研制PRRSV基因标识疫苗奠定了基础。     

不同佐剂制备鸡新城疫、禽流感二联灭活苗免疫效果评价试验

基于对市场现有佐剂产品的了解取不同佐剂产品作比较,以禽类疫苗为例。选取鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗(Lasota株+WD株)灭活后抗原液,按不同佐剂的配苗比例分别配制灭活苗,验证其免疫效果。将添加不同佐剂配制的灭活苗分别免疫7日龄商品肉鸡,分6组,每组30只,其中1～5组分别免疫5种不同佐剂配制的禽流感灭活疫苗,6组为空白对照,各免疫0.3ml/只。分别于免疫后14、21、28、35d采血,离心后取血清,利用血凝抑制方法分别检测鸡新城疫和H9亚型禽流感血清抗体。计算抗体平均滴度。试验结果显示,MF59、GEL02和ISA70VG等新型佐剂较传统佐剂均能产生较高的抗体水平且能使机体在短期内快速产生免疫应答反应并能很好的维持其抗体水平。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒M蛋白/N蛋白间与N蛋白/3'UTR引入重复序列的反向遗传操作

为获得一种经全长cDNA突变体拯救出的、随着传代次数的增多而最终致死的突变病毒,以嵌合感染性克隆p7AX12为骨架,分别在猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)M蛋白与N蛋白间或(和)N蛋白/3'UTR之间插入32 nt,依次构建4个嵌合突变体pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R,经DNA转染Marc-145细胞后4个嵌合突变体均能拯救出病毒,且拯救病毒中的突变或插入的碱基具有遗传稳定性。突变病毒传代5次,没有最终致死的原因还有待于进一步研究分析。获得的4个突变病毒也为研制PRRSV基因标识疫苗及PRRSV复制转录机制研究奠定了基础。     

猪源牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种荧光定量PCR检测方法,用于猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDVs)检测,同时能鉴别诊断猪瘟病毒(CSFV).根据BVDVs与CSFV 5 '-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDVs 5′-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线.以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测.结果显示,该方法检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性;最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20％～0.95％;应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7％.本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDVs、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测.