结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合基因的表达及其多克隆抗体的制备

以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组DNA为模板，经重叠PCR扩增获得CFP10-ESAT-6融合基因片段，克隆于pET21a表达载体中，获得了重组质粒pET21a—CFP10—ESAT—6，将其转化大肠杆菌BL21细胞，经IPTG诱导表达，得到了25ku的目的蛋白。表达产物经纯化和定量分析后免疫新西兰大白兔，收集兔血清进行抗体ELISA检测。结果显示，成功构建了CFP10-ESAT-6融合基因的原核表达质粒，获得了CFP10-ESAT-6融合蛋白，以此蛋白免疫动物可产生高效价的抗体。     

牛分支杆菌ESAT-6/Ag85B/Mtb8.4基因与牛IL-2基因融合表达

本研究拟制备牛IL-2与牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因的融合蛋白。从患结核病鹿的肺组织中分离牛分支杆菌并提取基因组DNA,PCR扩增牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因;提取牛淋巴细胞,经总RNA提取、RT-PCR得到了IL-2基因片段。经测序鉴定后,将4个目的片段重组,构建原核表达载体,并对表达的融合蛋白进行鉴定。克隆出了牛IL-2,以及牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因;构建了原核表达载体pME290-SDCZ,并表达出了融合蛋白;Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗牛分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。制备了牛IL-2与牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4融合蛋白,本研究为下一步研制重组牛结核亚单位疫苗奠定了基础。     

结核分支杆菌MPT83在真核、原核表达载体中的克隆、表达与鉴定

为了克隆、鉴定和表达结核分支杆菌抗原蛋白 MPT83 ,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础。以结核分支杆菌标准菌株 H3 7RV基因组 DNA为模板 ,PCR扩增目的基因 mpt83 ,扩增产物酶切后分别克隆到真核、原核表达载体 p JW43 0 3和p ET2 2 b( )中 ,构成重组真、原核表达载体 83eu和 MPT83。经酶切和序列鉴定为正确的重组真核表达载体 83 eu和重组原核表达载体MPT83 ,分别转染 COS7细胞和转化 BL2 1( DE3 ) plys S。结果表明 ,经 SDS-PAGE、Westernblotting检测显示 ,IPTG诱导的原核表达载体MPT83在 2 .6万处有正确而特异的蛋白条带 ;转染 COS7细胞的真核表达载体 83 eu,Westernblotting检测表明也有与结核分支杆菌抗血清特异反应的蛋白条带     

GST pull-down验证新城疫病毒基质蛋白与鸡importinβ1蛋白的相互作用

旨在利用GST pull-down技术验证新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外的相互作用。根据NDV ZJ1株M基因和鸡importinβ1基因序列设计引物,通过PCR扩增获得NDV M基因和鸡importinβ1基因,将其分别定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)构建重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importinβ1,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,SDSPAGE检测重组蛋白的表达情况,并对包涵体重组蛋白进行变性和复性处理。然后以GST-M重组蛋白为诱饵蛋白,His-importinβ1重组蛋白为猎物蛋白,利用GST pull-down技术验证M蛋白与importinβ1蛋白的相互作用。结果表明,成功构建了重组原核表达载体pGEX-6p-M和pET-32a-importinβ1,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得了正确表达。SDS-PAGE电泳检测显示GST-M重组蛋白主要以包涵体形式存在,而His-importinβ1重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。利用蛋白重折叠试剂盒获得了有活性的GST-M重组蛋白,将其作为诱饵蛋白,可以捕获并检测到His-importinβ1重组蛋白,但是GST标签蛋白不能结合His-importinβ1重组蛋白。利用GST pull-down技术证实了NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外具有直接的相互作用,这为深入研究importinβ1蛋白在NDV M蛋白细胞核定位的分子机制以及在NDV复制和致病中的作用奠定了基础。     

结核分支杆菌Mtb8.4真核、原核表达质粒的构建与表达

低分子质量蛋白抗原Mtb8.4是一种非常重要的结核分支杆菌抗原,为了研制结核病核酸疫苗和进行结核病的诊断,分别将其构建到原核和真核载体中进行表达。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因Mtb8.4,扩增产物酶切后分别克隆到真核表达载体pJW4303和原核表达载体pGEX-4T-1中,构成重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4,用限制性内切酶消化,PCR扩增及DNA序列分析等多种方法鉴定;并将正确构建的原核表达载体转入E.coliBL21(DE3)plysS中,IPTG诱导表达。结果表明,重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4构建成功。构建的真核重组质粒pJW-Mtb8.4即可作为结核病DNA疫苗。原核表达载体pGEX-Mtb8.4在BL21(DE3)plysS中成功表达,将表达蛋白进行纯化,作为保护性结核分支杆菌抗原以便检测DNA疫苗的免疫效果。     

牛分支杆菌MPB70和CFP10-ESAT6基因的表达与检测

以牛分支杆菌染色体DNA为模板,分别以MPB70、CFP10-ESAT6融合蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约600 bp的DNA片段,并将其克隆入PQE30质粒,构建出原核表达载体PQE30-MPB70,PQE30-CFP10-ESAT6.将质粒转化至感受态DH5α中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见相应外源蛋白带.纯化蛋白后作为包被抗原建立ELISA方法,为进一步研究牛结核病诊断方法奠定基础.     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。     

大约克猪SLA-1原核表达载体的构建及表达

为构建大约克猪SLA-1胞外区的原核表达载体及表达目的蛋白,试验设计1对引物,经PCR扩增获得大约克猪SLA-1胞外区基因（命名为SLA-1-DYKe）,将此片段克隆至pMD^®19-T Simple Vector,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选阳性克隆菌并测序,将目的基因插入到原核表达载体pET-28a（+）中,转化至宿主菌BL21（DE3）进行诱导表达,用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况,大量诱导提取包涵体并检测。结果显示,PCR成功扩增SLA-1-DYKe的胞外区,得到大小为837 bp的目的基因,目的基因成功克隆至pMD^®19-T Simple Vector,并获得序列正确的重组质粒。以得到的重组质粒成功构建了SLA-1-DYKe/pET-28a（+）表达载体,目的蛋白大小约为34 ku。本研究成功构建了大约克猪SLA-1原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后研究大约克猪SLA-1的空间结构和基因功能奠定了基础。     

牛分支杆菌CFP-10的原核表达及其在牛结核病诊断中的应用

低分子质量的蛋白抗原CFP-10是一种重要的牛分支杆菌早期分泌蛋白.为了检测该蛋白和其他几种抗原在牛结核病诊断中的临床应用,对CFP-10的基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达.PCR法扩增cfp-10基因片段,连接到pET-22b( )原核表达载体中,再转入表达宿主E.coli BL21(DE3)PlysS菌株内,用IPTG诱导,进行蛋白表达、纯化.分别以CFP-10、ESAT-6、MPT83、MPT70、牛PPD、CFP-10与ESAT-6混合蛋白,MPT83与MPT70混合蛋白为抗原,用间接ELISA法诊断牛结核病.结果表明,以CFP-10与ESAT-6混合蛋白作为抗原检测牛结核病的特异性和敏感性分别达到了100%和63.6%,均超过了其他单抗原或抗原组合,为以筛选合适抗原为基础的血清学诊断技术提供了有力的支持并创造了良好的应用前景.     

胸膜肺炎放线杆菌4型菌毛亚单位基因apfA特异性片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板，PCR扩增其apfA特异性基因片段，PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切及序列分析鉴定后，亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，构建重组表达质粒pGEX-apfA，转化到感受态大肠杆菌DE3中，以IPTG进行诱导，进行SDS-PAGE电泳。结果表明，25-4株apfA基因与基因库中标准7型apfA基因的同源性达到98％，所表达的融合蛋白相对分子质量约为42000，与预测值相符。apfA特异性基因片段的成功克隆和表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病致病机理的研究及新型疫苗的研制打下了基础。     

结核分枝杆菌三种分泌蛋白在原核表达载体中的克隆、表达与鉴定

对结核分枝杆菌的三种分泌蛋白Ag85B,ESAT-6和MPT－64基因进行克隆、鉴定与表达，为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。以结核杆菌H37RV株基因组DNA为模板，用PCR法对基因Ag85B、ESAT－6、MPT－64进行扩增，产物与载体质粒pET22b和pGEX-4T-1构建表达Ag85B、ESAT－6、MPT－64的重组质粒，将此重组质粒先转化到大肠杆菌DH5a内抽提质粒，酶切检验，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）PLysS菌株内，对转化菌株以IPTG进行诱导后，破菌，离心，上清进行SDS－PAGE电泳，电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，所表达的蛋白质相对分子质量为30000、6000、50000。结果表明：目的基因克隆到菌株内，重组结核杆菌分泌蛋白Ag85B、ESAT－6、MPT－64的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述三种抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

J亚群禽白血病JL-2株gp85基因的克隆与表达

本实验在分离鉴定J亚群禽白血病JL-2株的基础上,利用PCR方法扩增出包括gp85基因在内的长度为960bp的DNA片段.将其连到PGEX-6p-1载体上,构建了重组表达质粒PGEX-6P-1/gp85,对质粒进行序列分析并在IPTG的诱导下进行表达.SDS-PAGE分析结果表明,融合蛋白(54 Ku)在BL21中得到有效表达.表达产物占菌体总蛋白的31.8%.Western Blot结果表明,表达产物可与ALV-J阳性血清发生特异性反应.这些结果为进一步研究gp85蛋白的功能及研制ALV-J ELISA诊断试剂盒奠定了基础.     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因的克隆、表达及其免疫活性研究

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34 kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc.GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测.结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应.OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础.     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIVA基因特异片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25＿4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18＿T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX＿6P＿1中,构建成重组表达质粒pGEX＿apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS＿PAGE电泳。结果表明,25＿4株apxIVAgene与基因库中标准7型apxIVAgene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符。apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础。     

H7亚型禽流感病毒HA1基因的克隆与原核表达

利用PCR技术亚克隆了H7亚型禽流感病毒的HA1基因,并将PCR产物连接到克隆载体pMD 18-T Simple vector,转化大肠杆菌。测序结果表明所克隆的片断大小为1035bp。将HA1基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,经酶切和PCR鉴定,证明成功构建了重组表达载体pGEX-HA1。将构建好的融合表达载体在IPTG的诱导下在大肠杆菌中得到了表达。融合蛋白GST-HA1的分子量为63ku。Western-Blot和ELISA鉴定结果表明,融合蛋白与H7亚型禽流感阳性血清发生特异性反应,而与H5、H9亚型抗血清不发生反应。     

梅花鹿促卵泡激素α亚基基因克隆与融合表达

以原构建的克隆载体为模板,PCR扩增梅花鹿FSHα亚基基因,TA克隆后经双酶切插入表达载体pGEX-6P-2,阳性克隆导入E.coli BL21,IPTG诱导表达GST-FSHα融合蛋白,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果表明,FSHα PCR产物大小约380 bp,测序结果与GenBank序列一致;重组表达载体pGEX-6P-2-FSHα构建成功;融合蛋白经SDS-PAGE分析,结果发现,在分子质量39.3 ku处出现特异性蛋白质条带,说明梅花鹿FSHα亚基基因片段已在E.coli BL21中成功表达了FSHα-GST融合蛋白。     

牛分支杆菌热休克蛋白65基因的分子克隆和表达

以牛型分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增热休克蛋白65(Hsp65)基因,PCR产物经纯化与EcoRⅠ/SaⅠ双酶切后与经同样处理的原核表达载体pGEX-6P-1进行连接,转化感受态细胞BL21中,筛选和构建了原核重组表达质粒pGEX-H65,核苷酸序列测定验证其正确性.以1 Mol/LIPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,Hsp65基因表达的融合蛋白GST-H65裂解为两部分;即64 kD和22 kD,两个蛋白分子量相加与预测的86 kD(HsP60 kD GST26 kD)相符.牛分支杆菌热休克蛋白HSP65的成功表达为其功能的研究打下基础.     

传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。     

产志贺毒素样大肠杆菌F18ab菌毛操纵子基因的体外非诱导系统的表达和鉴定

以产志贺毒素样大肠杆菌（SLTEC）F18ab血清型标准菌株107/86基因组DNA为模板,利用PCR技术成功扩增出编码F18ab完整菌毛操纵子fed基因,克隆入表达载体pBR322,经限制性内切酶酶切分析,DNA琼脂糖电泳鉴定并结合序列测定分析,构建和筛选出含fed完整基因正确插入的pBR322-fed重组质粒,将上述重组质粒转化至不含任何菌毛结构的大肠杆菌SE5000,该表达重组菌能分别与兔抗F18ab亚单位蛋白FedF高免血清、鼠抗F18ab菌毛a单因子单克隆抗体、兔抗F18ab菌毛高免血清和抗F18ab菌毛IgG抗体产生明显的凝集反应。用热抽提法分别抽提和纯化SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000（pBR322-fed）体外表达的F18ab菌毛,纯化菌毛经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色获单一相对分子质量约为15 000蛋白条带。Western-blotting结果表明：兔抗F18ab菌毛高免血清能特异性识别SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000（pBR322-fed）所提纯的单一主要结构蛋白。用重组菌SE5000（pBR322-fed）进行易感仔猪小肠上皮细胞体外黏附试验和黏附抑制试验,结果表明：重组菌SE5000（pBR322-fed）和SLTEC F18ab标准株107/86一样具有较强的黏附易感仔猪小肠上皮细胞的能力,而兔抗F18ab菌毛高免血清能有效地抑制上述重组菌SE5000（pBR322-fed）和SLTEC F18ab标准株107/86对易感仔猪小肠上皮细胞的黏附结合。