猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因特异片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18-T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组表达质粒pGEX-apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,25-4株apxIVA gene与基因库中标准7型apxIVA gene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符.apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础.     

胸膜肺炎放线杆菌4型菌毛亚单位基因apfA特异性片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板，PCR扩增其apfA特异性基因片段，PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切及序列分析鉴定后，亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，构建重组表达质粒pGEX-apfA，转化到感受态大肠杆菌DE3中，以IPTG进行诱导，进行SDS-PAGE电泳。结果表明，25-4株apfA基因与基因库中标准7型apfA基因的同源性达到98％，所表达的融合蛋白相对分子质量约为42000，与预测值相符。apfA特异性基因片段的成功克隆和表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病致病机理的研究及新型疫苗的研制打下了基础。     

血清6型猪传染性胸膜肺炎放线扦菌的分离与鉴定

从广东某猪场出现呼吸困难、肺脏有出血性纤维渗出性病变的病死猪中分离出1株有多形性趋向的革兰阴性球杆菌，卫星现象观察、CAMP试验及V因子依赖性试验均为阳性，用PCR方法能扩增出各血清型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌均有的apxIVA基因长约422bp的特异片段，小白鼠攻毒试验显示其有致病性，血清学检测表明该分离茵为血清6型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxIICA基因的克隆和基因缺失

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25＿4株ApxIICA基因用特异性引物进行PCR扩增并克隆到T载体上,构建重组质粒pMD18＿ApxIICA,将pMD18＿ApxIICA转化到E.coliJM83中并测序。序列分析表明血清型7型25＿4株ApxIICA与其它血清型(5型和9型)核苷酸序列同源性达98%以上,氨基酸序列同源性达90%以上。利用ApxIIC基因内部单一的SpeI位点,设计特异性的引物,利用PCR技术在ApxIIC基因内部缺失165bp的核苷酸片段,PCR产物再用SpeI进行酶切,并体外连接构建得到含有ApxIIC缺失基因的重组质粒pMD18＿ApxII△CA。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

利用菌落多重PCR对传染性胸膜肺炎放线杆菌进行血清分型

参照文献报道的传染性胸膜肺炎放线杆菌的特异基因合成5对特异引物,建立传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分型的菌落多重PCR方法,结果为10株传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型参考菌株均扩增出了相应的预期片段,而支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌的扩增均为阴性。利用此多重PCR方法对41株传染性胸膜肺炎放线杆菌分离菌株进行血清型分型,结果所有菌株均扩增出了相应的特异片段,其中6株为1型,5株为7型,1株为5型,29株为9型。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因的克隆、表达及其免疫活性研究

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34 kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc.GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测.结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应.OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础.     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白（OMP）5’末端保守区基因的克隆、表达及其免疫活性研究

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板，PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5’末端保守区基因片段(OMPc)，酶切及核苷酸序列分析鉴定后，与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接，构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc，转入大肠杆菌B121中，以IPTG进行诱导，SDS-PAGE电泳分析发现，转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34kD，与实际预测相符，命名为GST-OMPc。GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测。结果表明：纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应。OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因的克隆和表达

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌溶血素(Apx)ⅣA基因的原核表达,试验采用PCR方法扩增到目的片段,并将该片段连接到pMD18-T载体中,经PCR和限制性酶切鉴定后,在T4 DNA连接酶的作用下将目的片段与pET28a连接。结果表明:ApxⅣA基因测序结果与GenBank中公布的核苷酸序列的同源性达100%,说明已成功构建猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-pET28a原核表达质粒;表达质粒经IPTG诱导成功表达了36 ku的ApxⅣA原核蛋白。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用

根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因设计1对引物，扩增特异的650bp棱酸片段，建立了应用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。特异性试验结果表明，12个血清型的放线杆菌参考菌株均能扩增出650bp特异性的核酸片段，而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、伤寒沙门氏菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明，PCR的最低检出限量为500个放线杆菌。利用建立的PCR检测方法对22株从山东省不同地区分离的疑似胸膜肺炎放线杆菌菌株进行检测．结果14株为阳性。对感染猪病变组织的检测结果表明，病变部位不同，胸膜肺炎放线杆菌的检出率不同，其中以扁桃体的检出率最高。     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段的克隆及原核表达

根据GenBank公布的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1蛋白羧基端序列(AF290001.1),设计合成2对特异性引物,采取套式PCR方法,以肺炎支原体培养物中提取的DNA为模板,扩增肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,将其克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a/P1(3 802～4 695),转化大肠埃希菌BL21-gold,测序验证后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE表明重组蛋白表观分子质量与预期一致,可溶性表达产物经Western blot证实重组蛋白具有免疫反应性。     

鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。     

鹅细小病毒延边株VP1基因真核表达质粒构建及其在Vero细胞中的表达

根据GenBank已发表的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列,设计并合成1对含有Xho I和BamH I酶切位点的特异性引物,以提取的GPV基因组DNA为模板,经PCR扩增得到了1 163 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建重组表达质粒pVAX1-VP1。经PCR鉴定、酶切分析和序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。通过脂质体法将pVAX1-VP1转染Vero细胞,经间接荧光抗体检测,在Vero细胞表面可见特异性荧光。经RT-PCR扩增得1 163 bp的目的片段。该研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础。     

大肠埃希菌K88ac菌毛蛋白亚基因的原核表达及其免疫原性研究

从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体形式获得高效表达.Western blot结果显示,表达的蛋白能够被K88ac单抗识别,用纯化的蛋白免疫小鼠,能够抵抗1 MLD大肠埃希菌强毒株C83902的攻击,这表明构建的工程菌株XL1-Blue(pQE30-K88ac)可以作为预防幼畜大肠埃希菌性腹泻基因工程菌苗的候选株.     

炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合蛋白的原核表达及其反应原性研究

【目的】构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202PA-LF1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据。【方法】根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF1基因片段,经XhoⅠ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF1融合基因片段,利用SWISS-MODEL分析软件分别对PA、LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(＋)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性。【结果】从炭疽芽孢杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF1和PA-LF1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。【结论】PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分。     

秦川牛生长抑制素基因克隆及原核表达研究

 试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。提取秦川牛的骨骼肌总RNA,根据基因库中海福特牛肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上Bam HⅠ和Xho Ⅰ酶切位点及保护碱基,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经Bam HⅠ和Xho Ⅰ双酶切,将目的片段插入到PGEX-4T-1中,构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,将重组表达质粒转化至Rosetta(DE3)中诱导表达。结果表明,扩增的秦川牛肌肉生长抑制素全长基因1 128 bp,克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与GenBank上发表的一致;成功构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导,表达出了GST-M融合蛋白,用GST标签抗体做Western blotting印记证明产物大约69 ku,与预期大小相符,并在Rosetta（DE3）菌中成功的进行融合蛋白表达。     

山羊痘病毒P32基因重组表达载体的构建及原核表达

以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-28a-P32/LD,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,有分子量约为35.5 ku的融合蛋白获得表达,与预期结果相符;Western-Blotting证实该表达蛋白具有免疫学活性。P32蛋白的成功表达为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。     

大肠杆菌O157:H7菌毛分子伴侣基因的克隆与表达

根据Genebank中已登录的大肠杆菌O157:H7菌株EDL933基因序列中茵毛分子伴侣ycbR基因序列设计1对引物,并分别在其5'端分别加入Neo I、Xho I酶切位点,以大肠杆菌O157:H7国内分离株97094的DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出710 bp的DNA片段.回收并纯化该DNA片段,用限制性核酸内切酶Nco I、Xho I同时消化DNA片段和双酶切栽体质粒pET28a(+).将它们回收纯化并连接,然后转化到宿主菌大肠杆菌DH5a,从该菌中提取重组质粒,用PCR、限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定,表明ycbR基因定向克隆到了载体质粒pET28a(+).再将重组质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),在含Kan抗生素LB培养基中经IPTG诱导12～16 h,做SDS-PAGE分析,表明ycbR基因在菌株中获得高效表达,表达蛋白相对分子质量大小约为30 000,与预期结果一致.为研究大肠杆菌ycbR基因产物的功能和致病作用奠定了基础.