猪A组轮状病毒VP4全基因在大肠杆菌中的表达与检测

以猪轮状病毒mRNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了2331bp的VP4全基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆质粒pGEM-T-VP4.以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pGEM-T-VP4和pGEX-6P-1,并将纯化的VP4基因亚克隆至融合型表达载体pGEX-6P-1中,构建出原核表达质粒pGEX-6P-VP4.将pGEX-6P-VP4转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约111.47 ku融合蛋白带.Western blot分析发现,该蛋白具有轮状病毒抗原性,从而为进一步研究轮状病毒的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础.     

BALB/c小鼠Doppel蛋白的原核表达及其抗血清的制备

利用已克隆的BALB/c小鼠Doppel蛋白基因,将其成熟蛋白编码区亚克隆至表达载体pGEX-6P-1上,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-PRND。将重组蛋白表达载体转入E.coli BL21（DE3）中诱导表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果表明,BALB/c小鼠Doppel蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。对表达的蛋白进行提取和纯化并免疫新西兰大白兔制备兔抗血清,初步建立了小鼠睾丸Doppel蛋白组织学分布的免疫组织化学方法。为进一步研究Doppel的结构、功能及其在TSEs发生发展中的作用提供基础材料和数据。     

单核细胞增生性李斯特氏菌hly基因的克隆表达

以单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria Monocytogengs,LMO）LMO-0586基因组DNA为模板,运用PCR扩增得到片段大小为1646bp的致病基因李氏溶血素（hly）基因,并克隆到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-hly。经测序正确后,将hly基因克隆至表达载体pGEX上构建表达质粒pGEX-6P-1-hly。在IPTG诱导下,携带pGEX-6P-1-hlyA的E．coli BL21（DE3）高效表达分子量约为82KDa的可溶性蛋白及包涵体形式的蛋白。为进一步研究溶血素蛋白的结构、功能,LMO的分子流行病学调查、诊断试剂盒的开发提供依据。     

北京鸭抑制素α-亚基免疫原的制备及活性研究

将重组有北京鸭抑制素α-亚基基因的T载体和pET-28a表达载体分别用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接并转化E. coli BL21(DE3),经PCR和双酶切鉴定,筛选得到阳性重组表达载体,在IPTG诱导下融合表达了北京鸭抑制素α-亚基蛋白。试验结果表明,抑制素α-亚基基因在E. coli BL21中得到了有效表达,表达产物具有免疫活性,为后期探讨该免疫原提高北京鸭产蛋性能的研究奠定基础。     

单增李斯特氏菌actA基因的克隆及原核表达

利用PCR技术从单增李斯特氏菌中扩增出actA基因,将PCR产物纯化后克隆到pMD 18Tsimple vector中,成功构建出克隆载体pMD-18T/actA。以BamHⅠ和EcoRⅠ分别双酶切pMD-18T/ActA和表达载体pGEX-3X,将纯化的actA基因亚克隆到表达载体pGEX-3X。构建的重组表达载体pGEX-3X/ActA转化到E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE分析,可见约120 ku外源蛋白带,Western blot分析表明该蛋白可与单增李斯特氏菌多克隆抗体发生特异性反应。该研究为ActA的生物学特性和功能的研究及诊断试剂的研制奠定了基础。     

新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析

应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段.经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F.重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F).经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%.Western blotting结果显示,在相对分子质量46 ku位置有特异性条带.动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P＜0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性.     

牛分枝杆菌MPB70基因的克隆表达

以牛分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增其特异性蛋白(MPB70)基因,获得约600 bp的DNA片段,并将其克隆入pGEX-6P-1质粒,构建出原核表达载体pGEX-6P-1-MPB70。将质粒转化至感受态BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析可见相应蛋白带。Western blot分析证实,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究牛结核诊断方法奠定基础。     

布鲁菌外膜蛋白Omp22基因的原核表达与生物信息学分析

克隆布鲁菌Omp22基因,原核表达后进行生物学信息分析。根据GenBank中羊种布鲁菌M5-90株基因组PCR扩增出639bp的目的基因片段,构建克隆重组质粒pMD-20T-Omp22,转化入E.coli DH5α。测序正确后构建表达重组质粒pET-28a-Omp22,转化入E.coli BL21(DE3)。IPTG诱导表达,Western blot鉴定诱导融合蛋白。结果表明,成功克隆Omp22基因,构建pET-28a-Omp22原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达Omp22基因。DNA Man和BIOEDIT软件生物性息学分析Omp22融合蛋白二级结构中α-螺旋占22.17%;伸展链占19.81%;β-折叠占2.83%;无规卷曲占55.19%。说明该蛋白具有较高亲水性。     

传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。     

马动脉炎病毒N蛋白基因GST融合表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法扩增出马动脉炎病毒核衣壳蛋白基因0RF7,并将其克隆到pMDl8-T载体,构建成重组质粒pMDl8-N,在上海生物工程公司测序。结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与EAVNC-002532株的同源性为99％。表明0RF7是EAV基因组内的保守序列,将0RF7亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组质粒pGEX-6P-N,用pGEX-6P-N转化表达菌株BL21（DE3）,诱导表达后SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,克隆在谷胱苷肽硫转移酶（GST）下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子质量约为40ku,为马动脉炎病毒病血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

羊种布鲁氏菌Omp10基因的克隆及原核表达

根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis) M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381 bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测序正确后,构建pET-28a-Omp10原核表达质粒,再将该质粒转化入E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达融合蛋白His-Omp10,用SDS-PAGE和Western blotting进行分析.结果表明, 成功构建了含Omp10基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了Omp10基因,诱导得到的融合蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明Omp10得到成功表达.该试验为布鲁氏菌病的进一步研究奠定基础.     

α-银环蛇毒素融合基因表达载体的构建及原核表达

设计并人工合成2条引物,对作者构建的重组质粒pMD-α-BGT进行PCR扩增获得α-BGT基因。将目的基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT。克隆质粒经BamHⅠ、NotⅠ双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,成功构建融合基因表达载体pGEX-α-BGT,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。表达产物经15%SDS-PAGE分析,在约34ku处可见明显的外源蛋白质表达带,与预计的分子量大小一致,其表达量约占细菌总蛋白的32.6%。Westernblotting和间接ELISA检测结果表明,α-BGT的融合表达蛋白与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。     

家蚕G蛋白α亚基基因BmGα12的克隆及序列分析与融合表达

异三聚体G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到细胞内的重要分子,参与生物体内广泛的信号转导途径。采用生物信息学方法和RT-PCR、RACE技术克隆了家蚕G蛋白α亚基基因BmGα12的全长cDNA序列,该序列全长1374 bp,开放阅读框(ORF)1 128 bp,编码375个氨基酸。将构建的表达载体pET-41b(+)-Gα12转化E.coli BL21宿主菌进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测显示,BmGα12可在E.coli BL21中高效表达,GST-BmGα12融合蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约71 kD。系统进化分析显示BmGα12与大鼠和人Gα12/Gα13的亲缘关系较近,初步推测BmGα12介导的信号传导同样在细胞生长、胚胎发育中起重要作用。     

结核分支杆菌Rv3117基因的克隆与原核表达

以结核分支杆菌H37Rv株染色体DNA为模板,应用Rv3117基因特异性引物对该基因进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。将PCR纯化产物克隆至pMD-18T Vector中,构建出重组质粒pMD-18T-Rv3117。以EcoRⅠ和SamⅠ双酶切pMD-18T-Rv3117重组载体和pGEX-4T-1原核表达载体,并将纯化的Rv3117基因亚克隆至pGEX-4T-1中,构建出原核重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3117。将pGEX-4T-1-Rv3117重组质粒转化至感受态E.coli BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约30ku目的蛋白带。Western blot分析结果显示,该蛋白能与抗结核分支杆菌阳性血清发生特异性反应。研究结果为结核病临床诊断抗原的筛选奠定了基础。     

新疆细毛羊抑制素α亚基cDNA的克隆、序列分析与表达

根据GenBank上登录的绵羊抑制素α亚基基因序列,设计合成2对引物,以新疆细毛羊卵巢提取的总RNA为模板,采用RT—PCR方法扩增获得了约812bp片段,经pMD18-T载体克隆和测序分析证实为新疆细毛羊抑制素α亚基前体基因。进一步通过PCR反应扩增新疆细毛羊INHα亚基基因片段,经过NcoⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆于pET32a原核表达载体,获得pET—INH重组表达载体。将携带有重组表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol·L^-1IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大约为32ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。新疆细毛羊抑制素α亚基基因的克隆、表达为进一步研究其功能和应用奠定了基础。     

禽流感病毒NA基因稀有密码子分析及其原核表达

通过原核表达获取禽流感病毒(AIV)NA蛋白,为深入研究该蛋白的抗病性奠定基础.本试验以pMD19-T-NA为模板,PCR扩增M基因完整开放阅读框(ORF),然后克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建表达质粒pET-NA;转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析检测;并利用稀有密码子在线分析软件对NA基因ORF进行分析.SDS-PAGE分析显示融合蛋白获得了表达,大小为65.4 ku;稀有密码子统计表明,NA基因ORF中稀有密码子的比例高达13.4%,甚至还有多个稀有密码子串联成簇存在.重组质粒pET-NA构建正确,且在Ecoli BL21(DE3)中成功诱导表达出目的蛋白.     

新城疫病毒核衣壳蛋白基因在大肠埃希菌中的表达、纯化及其活性分析

构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。     

破伤风毒素C片段基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

本研究对破伤风毒素C片段进行了基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。应用PCR技术直接从破伤风梭菌64008菌株基因组中扩增出大小为1356 bp的破伤风毒素C片段(TetC)基因,经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank上登录的序列AF154828的同源性达到99.2%。将此基因克隆至大肠杆菌融合表达载体pGEX-6P-1,构建成重组表达质粒pGEX-6P-1-TetC,并在大肠杆菌BL21中表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的21%。经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为76 Ku左右的重组蛋白,经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。     

GFP-ESAT6融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

根据GenBank中发表的结核杆菌H37RV的ESAT6基因序列设计1对引物,以热灭活的结核杆菌H37Rv菌悬液为模板,用PCR方法扩增得到EsAT6基因DNA片段.将扩增片段克隆于pGM-T载体中,成功构建克隆载体pGM-T-ESAT6.分别将pET28a-GFP质粒和pGM-T-ESAT6质粒用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,并将纯化的ESAT6基因亚克隆至pET28a-GFP中,构建原核表达载体pET28a-GFP-ESAT6.将pET28a-GFP-ESAT6转化E.coli BL 21(DE3),经IPTG诱导、SDS-PAGE和Western-blot分析,可见相对分子质量约37 200的外源蛋白带,表明GFP-ESAT6融合基因在大肠杆菌中得到了表达.用Ni-NT、A Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-ESAT6融合蛋白.     

布鲁氏菌外膜蛋白16基因的克隆及原核表达

为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。