人补体C1INH基因的原核表达及其抗血清的制备

 采用PCR技术获得人补体C1INH基因全长,以其为模板扩增出抗原表位基因片段命名为C1,然后将C1片段重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌;IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21培养物,纯化蛋白后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析表明,pET32a-C1融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6 400;Western-blot检测显示,抗血清可与原核表达的C1INH蛋白进行特异性结合,为进一步检测真核表达蛋白及研究rhC1INH的功能活性,并为C1INH的临床检测奠定基础。     

猪α干扰素基因在pET32a表达载体中的表达和鉴定

利用PCR技术从猪瘟免疫猪血中提取基因组,并从中扩增出约500 bp的基因片段;将此基因片段克隆于大肠杆菌pMD18-T载体,经PCR、测序鉴定后,将其片段克隆于pET32a(+)载体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明,猪α干扰素在pET32a原核表达载体中成功地获得了分泌表达,且表达蛋白在PK-15细胞上表现出较强的抗病毒活性,这为进一步研究猪α干扰素的功能和开发奠定了基础.     

基于噬菌体展示技术筛选抑制素α亚基特异性纳米抗体

【目的】通过噬菌体展示技术构建抗抑制素α亚基(INHα)纳米抗体文库,并筛选出针对绵羊INHα的特异性纳米抗体,以期制备出新型抑制素免疫制剂,为提高绵羊外周血促卵泡素(FSH)水平和排卵率做前期准备。【方法】利用pET32a-INHA原核表达载体诱导表达INHα蛋白,并对诱导表达的INHα蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;用Ni琼脂糖凝胶纯化后的INHα蛋白免疫新疆双峰驼。通过巢式PCR扩增制备骆驼噬菌体展示纳米抗体文库,通过三轮免疫亲和淘选及噬菌体ELISA从该文库中富集和筛选INHα特异性纳米抗体,并通过测序得知纳米抗体的基因序列;用蛋白-蛋白模拟对接初步鉴定该纳米抗体与INHα蛋白的亲和性。【结果】通过原核诱导表达及Ni琼脂糖凝胶纯化得到了大小为36 ku的INHα重组蛋白,通过Western blotting检测到约36 ku的蛋白条带;双峰驼通过6次INHα蛋白免疫抗体效价达到1∶1 024 000;通过巢式PCR获得了400 bp左右的VHH基因,通过电转化等试验构建了库容量为1.05×10¹²CFU的纳米抗体文库,文库阳...     

新城疫病毒HN蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达

以本实验室构建的含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组质粒为模板，设计引物通过PCR和重叠-延伸PCR扩增，获得HNa、HNb和HNa-L-b三种抗原结构域基因片段，BamHⅠ／HindⅢ双酶切定向克隆到原核表达载体pET32c，获得重组质粒分别命名为pET32c—HNa、pET32c-HNb和pET32c．HNa—L—b。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，筛选出阳性克隆，诱导表达并取产物进行分析。结果表明，HNa、HNb、HNa-L-b结构域基因片段均获得了融合表达。Western-blotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。本试验结果为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础。     

也木勒羊抑制素α亚基基因克隆及其真核表达

为了克隆也木勒白羊抑制素α(inhibinα,INHα)亚基基因和表达其重组蛋白质,本试验采集发情期也木勒白羊卵巢组织,并从中快速抽提总RNA,以此作为模板并根据白羊INHα亚基基因编码区序列(GenBank登录号:XM_004004955.1)设计合成1对引物,经反转录扩增获得了也木勒白羊INHα亚基基因编码区全长序列。并将扩增产物克隆到表达载体(pEGFP-N1)的ScalⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间,构建重组质粒pEGFP-INHα并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,后进行鉴定、测序,证明成功构建了INHα亚基基因的真核表达载体。将也木勒白羊INHα亚基基因与人、大猩猩、牛等动物的INHα亚基基因序列进行同源性比对分析,相似度都在50%以上,说明了抑制素基因具有高度保守性。用RT-PCR和Western blotting方法验证了INHα亚基基因的真核表达载体在BHK细胞中的成功表达及蛋白表达。     

水牛抑制素α亚基基因的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定.序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1 083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基酸的同源性分别为96%、80%、87%,表明抑制素α亚基是一组在进化上高度保守的蛋白质.将水牛抑制素α亚基基因CDS克隆到pET-30a表达载体中,转化宿主菌BL21(DE3)进行原核表达.在1 mmol/L IPTG 中,37 ℃诱导表达4 h后抑制素α亚基基因重组蛋白可成功获得表达.将表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量约为40 ku.     

禽呼肠孤病毒σC基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段为ARV σC基因.将该基因重组至pET32a(+)原核表达载体上成功构建了表达裁体pET32a-σC.该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h得到最佳表达.表达重组蛋白的相对分子质量为54 000,以包涵体形式存在.经Western-blot分析表明,该重组蛋白能于ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性.     

鸡支气管炎病毒N基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达

依据Genbank中传染性支气管炎病毒N基因序列,设计引物采用PCR方法从本实验室分离到的病毒株中扩增获得约1 230bp的N基因,并将N基因片段克隆插入pMD18-T载体获得pMD18-T-N;采用酶切(Eco RI、XhoI)的方法从已构建的T克隆质粒pMD18-T-N上获得IBVN基因片段,将其亚克隆插入原核表达载体pET32a,成功构建重组原核表达质粒pET32a-N。将重组质粒转入BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达,可稳定、高效地表达N蛋白。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为1mmol/mL的IPTG在37℃进行诱导,5h后表达量最高。这一原核表达载体pET32a-N的构建为进一步研究核酸疫苗奠定了前期基础。     

单增李斯特菌lmo2193基因克隆与原核表达

为了对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2193基因进行克隆及其原核表达,采用PCR方法扩增lmo2193基因,连接pMD19-T载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。将目的基因克隆至原核表达质粒p ET32a中,构建重组质粒pET32a-2193,并转化大肠杆菌感受态细胞,经诱导表达后,利用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白。结果显示:扩增得到的lmo2193基因序列长度为1 077 bp,与预期一致;该基因在大肠杆菌中大量表达,经SDS-PAGE检测和Western blot鉴定分析表明该产物为1个60 ku左右的融合重组蛋白。本研究成功克隆lmo2193基因,并获得大量表达,为进一步研究lmo2193基因功能奠定基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gC基因抗原活性区的克隆与表达

通过聚合酶链式反应从牛传染性鼻气管炎病毒Bartha Nu/67株中扩增得到病毒gC基因并克隆至T载体pMD20T,再以后者为模板扩增gC蛋白第15~177位氨基酸对应的抗原活性区片段gCd。将gCd插入原核表达载体pET32a构建重组表达质粒pET32a-bhv1gCd。限制性内切酶以及序列分析鉴定表明重组表达质粒克隆片段序列与阅读框正确。对重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)的培养物进行蛋白电泳,可检测到分子量约45ku的目的产物,IPTG诱导后5h表达量最高。免疫印迹试验结果证实,gCd重组蛋白与牛传染性鼻气管炎标准阳性血清发生特异性反应,表明gC抗原活性区片段在原核获得表达并具有良好的抗原性。该重组蛋白可用于建立ELISA等免疫诊断方法。     

堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子的克隆和表达

本研究扩增和克隆了堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子,并在大肠杆菌中表达出MIF重组蛋白。根据GenBank中的MIF mRNA序列,设计特异引物,采用PCR方法以堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库为模板扩增获得MIF基因,将MIF基因片段连接到原核表达载体pET-28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a—MIF,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,对表达产物进行Western blot分析。结果从堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中扩增出MIF基因片段,长度为709bp;经序列分析,扩增片段的核苷酸序列与GenBank中登录的MIF序列的同源性为99．5％;经SDS-PAGE检测表明重组质粒pET（28a）-MIF在大肠杆菌中以包涵体形式表达;Western blot分析证明堆形艾美耳球虫抗血清可与重组表达蛋白特异性结合。本研究结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

塞尼卡病毒VP1与VP3蛋白原核表达及蛋白纯化

利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达。优化蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。RT-PCR结果显示可扩增出792 bp SVV VP1与717 bp VP3目的片段,将VP1与VP3目的基因成功克隆至pET32a(+)载体,分别转化至BL21(DE3),成功地表达50 000 pET32a-VP1重组蛋白以及48 000 pET32a-VP3重组蛋白;pET32a-VP1及pET32a-VP3重组蛋白均在条件为37℃、0.6 mmol/L诱导剂诱导5 h表达量最高,重组蛋白均以包涵体的形式进行表达并且可纯化出目的蛋白。结果表明,本试验成功地利用原核表达系统表达并纯化SVV VP1与VP3重组蛋白,为制备单克隆与多克隆抗体、检测试剂盒研发以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

猪Sar1b基因的分子克隆、序列分析及原核表达

根据GenBank已发表的猪Sar1b基因序列（GenBank登录号：AY819557）设计1对引物,以猪肝脏组织总RNA的反转录产物为扩增模板,用RT-PCR方法扩增出猪Sar1b基因cDNA全长编码区,经过EcoRI-SalI双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-Sar1b重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol/LITPG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为26 ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。猪Sar1b基因的克隆和表达研究,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

来航鸡FOXL2基因的克隆与原核表达

根据GenBank已发表的红色原鸡FOXL2基因序列(登录号NM_001012612.1)设计引物,以来航鸡全血为模板,PCR扩增出其基因全长编码区,经BamHⅠ-HindⅢ双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-FOXL2重组原核表达载体.将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)通过0.5 mmol/L IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为37 000,与预期表达蛋白大小一致.Western blotting检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白.为进一步探索该基因的生物学功能奠定了基础.     

鹅FSH基因原核表达

促卵泡激素（follicle stimulating hormone,FSH）作为调节家禽卵泡发育重要的候选基因,但FSH在生物体内的半衰期非常短,本试验将具有延长基因半衰期作用的CTP序列添加到鹅FSH基因各亚基的C末端进行基因融合,以期获得pET32a-FSHα-CTP、pET32a-FSHβ-CTP和pET32a-FSHβ-CTP-α重组蛋白。设计去除目的基因信号肽和含有酶切位点的特异性引物,经融合PCR扩增获得了目的基因FSHα-CTP、FSHβ-CTP和FSHβ-CTP-α,通过构建原核表达载体pET32a-FSHα-CTP、pET32a-FSHβ-CTP和pET32a-FSHβ-CTP-α,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,蛋白纯化。结果显示,3个融合蛋白FSHα-CTP、FSHβ-CTP和FSHβ-CTP-α的IPTG最佳诱导时间分别为4、5和5h,最佳诱导浓度分别为0.2、0.8和1.5mmol/L,且都是以包涵体形式存在,相对分子质量分别为32 000、35 000和46 000,与预期大小一致。结果表明,本试验成功构建了鹅pET-32a-FSHα-CTP、pET-32a-FSHβ-CTP和pET-32a-FSHβ-CTP-α的原核表达载体,并对它们的重组蛋白进行了纯化,为开展鹅FSH的基因免疫研究和鹅rFSH生物制剂研发奠定基础。     

犬瘟热病毒N基因原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。     

大肠杆菌acrA基因的重组表达及其抗体的制备

以大肠杆菌E．coli ATCC25922株的染色体DNA为模板,PCR扩增AcrA蛋白部分基因,获得约691bp的DNA片段。将PCR产物克隆至pMD18-T载体中测序,并进一步将acrA亚克隆于pET28a原核表达载体中,进行该基因的诱导表达。表达的产物经SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析,可见一条约33ku的特异性蛋白条带。用纯化的acrA基因原核表达产物免疫獭兔,ELISA法检测不同时期獭兔抗体效价。蛋白质印迹结果表明,用表达的AcrA蛋白制备的acrA抗体能够用于检测大肠杆菌AcrA蛋白的表达水平。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

哈萨克羊抑制素α基因原核表达载体的构建及其诱导表达

本实验以新疆哈萨克羊睾丸组织为实验材料,提取组织总RNA,经反转录得到c DNA并以此为模板,用以Gen Bank(NM_001308579.1)序列为参考设计的特异性引物进行PCR扩增,之后将扩增产物与p ET32a(+)载体相连,构建重组质粒p ET32a(+)-INHα。将构建好的重组质粒转化到受体菌E.coli BL21中,经IPTG诱导,表达p ET32a(+)-INHα重组蛋白。对扩增产物的测序鉴定结果显示INHα基因克隆成功;经过酶切和测序鉴定确定准确构建了p ET32a(+)-INHα重组载体;经Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定,检测到INHα基因编码区全序列表达的重组蛋白单一条带,这说明原核表达载体构建成功并在原核细胞中正常表达,这为今后绵羊INHα基因的免疫功能研究提供了参考依据。     

新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b基因的克隆与表达

以表达新疆绵羊种布鲁氏菌外膜抗原蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b,探索其作为诊断抗原和分子疫苗的可能性。采用PCR扩增技术,从新疆绵羊种布鲁氏菌基因组DNA中扩增出OMP2b基因片段,将该片段克隆于原核表达载体PE-28a(+),构建成重组质粒,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测有无蛋白的表达。结果表明,获得长约1 083bp的PCR片段,序列分析结果与已知绵羊种OMP2b同源性达89.72%;SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量39 ku获得了新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b基因片段,并在大肠杆菌中实现了表达。