胞内分枝杆菌热休克蛋白65基因的克隆和原核表达

本研究以胞内分枝杆菌ATCC13950株基因组DNA为模板,应用巢氏PCR方法扩增热休克蛋白65(HSP65)基因,PCR产物经纯化后与PMD18-T载体连接构建克隆质粒PMD18-T-HSP65,并转化大肠杆菌感受态细胞DH5,筛选阳性克隆并测序,NdeⅠ和BamHⅠ双酶切PMD18-T-HSP65和表达载体PET15b,用T4连接酶4℃过夜连接,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,筛选和构建了原核重组表达质粒PET15b-HSP65,双酶切鉴定正确后,以终浓度为1mmol/LIPTG诱导并进行SDS-PAGE分析。结果表明,获得约65KD大小的蛋白,与预期结果相符,为胞内分枝杆菌及HSP65基因功能的研究打下基础。     

猪热休克蛋白40(Hsp40)的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

克隆猪热休克蛋白40 (heat shock protein 40,Hsp40)基因并构建其原核表达载体,以纯化的猪Hsp40蛋白为抗原免疫兔制备抗猪Hsp40多克隆抗体。参照GenBank收录的猪Hsp40全基因序列,设计1对特异性扩增其CDS区全序列的引物,利用RT-PCR方法扩增猪Hsp40基因;扩增产物经双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1-His,测序无误后转化Arctic Express (DE3) RP感受态高效表达宿主菌,优化其表达条件(时间、IPTG浓度、温度)后,将可溶性的猪Hsp40重组蛋白用His-Band Ni^+层析柱进行纯化,用纯化的His-Hsp40重组蛋白免疫兔以制备多克隆抗体。采用抗原亲和纯化法对制备的多抗进行纯化,并采用间接ELISA法检测抗体效价。利用Western blot检测重组蛋白的免疫原性和反应原性,以及抗体的特异性。结果显示,克隆得到的猪Hsp40基因片段长度为1 485 bp,表达出的可溶性His-Hsp40重组蛋白相对分子质量约为57 800,制备出的猪Hsp40蛋白多克隆抗体效价为1∶512 000,且该多抗能够特异性识别His-Hsp40重组蛋白和猪肺泡巨噬细胞中的Hsp40蛋白。结果表明,成功克隆了猪Hsp40基因,表达并纯化了猪Hsp40蛋白,制备的兔抗猪Hsp40蛋白多克隆抗体能够有效地应用于猪Hsp40蛋白抗原的检测。     

鸡堆型艾美耳球虫Hsp90克隆表达及其核酸疫苗的免疫保护作用

利用RT-PCR方法从鸡堆型艾美耳球虫(E.acervulina)子孢子中成功克隆热休克蛋白90(Hsp90)基因,并构建其原核和真核表达质粒pET30a-Hsp90和pVAX-Hsp90。重组表达的89 kD可溶蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,间接ELISA和Western-Blot表明,其反应性和特异性良好。真核表达质粒pVAX-Hsp90体外瞬时转染间接免疫荧光检测可见成功表达。雏鸡真核表达质粒免疫后进行攻虫保护试验,结果表明,pVAX-Hsp90组较空载体组及PBS组增重极明显(P0.01),且肠道病变减轻,OPG减少,抗球虫指数为166.17。综上初步评价了Hsp90核酸疫苗的免疫保护作用,表明Hsp90是一种潜在的鸡球虫保护性抗原。     

兔多杀性巴氏杆菌热休克蛋白60基因的原核表达及抗原性分析

为了研究多杀性巴氏杆菌(P.multocida,Pm)热休克蛋白60(Hsp60)基因表达产物的抗原性,试验根据已发表的Pm 70株序列(AE004439)设计了1对引物,采用PCR技术扩增了兔多杀性巴氏杆菌C51-17株Hsp60的基因序列,将扩增产物与表达载体pPRO-EX-htb连接,得到重组表达质粒pHT-Hsp60,再用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定并测序确认正确后,将重组表达质粒pHT-Hsp60转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达,进行SDS-PAGE分析和Western-blot检测。结果表明:SDS-PAGE表达蛋白约为60 ku,与预期的Hsp60分子质量一致;表达产物与兔多杀性巴氏杆菌阳性血清发生特异性反应,说明表达产物具有良好的抗原性。     

奶牛诱导型热休克蛋白70基因片段的克隆及其在大肠杆菌中的表达

热休克蛋白(Heat shock proteins,Hsp)是细胞受应激后产生的一类蛋白质,其中最重要的、高度保守的一类热休克蛋白是Hsp70[1].Hsp70-1A和Hsp70-1B几乎被相同的基因编码,被统称为Hsp70(Hsp72或iHsp70).Hsp70在未应激正常细胞或组织内以较低的不可检测到的低水平表达,当机体发生生理变化或遭受应激后会被诱导而迅速表达,因此被称为诱导型Hsp70.     

断奶日龄对仔猪肝脏Hsp70、Hsp90和Hsp27蛋白表达的影响

为研究不同断奶日龄对仔猪肝脏热休克蛋白70(Hsp70)、热休克蛋白90(Hsp90)和热休克蛋白27(Hsp27)表达的影响,对24头体重相近、健康的杜长大仔猪,按断奶日龄(14、21、28、35日龄)进行随机分组,每组包含6个重复,于42日龄处死取样,用蛋白免疫印迹法检测肝脏中上述蛋白的表达水平。结果表明,35日龄断奶组肝脏Hsp70蛋白表达水平显著低于21日龄断奶组(P0.05),35日龄断奶组Hsp90蛋白表达水平均显著低于14日龄和28日龄断奶组(P0.05),35日龄断奶组Hsp27蛋白表达水平均显著低于其他3个断奶组(P0.05)。结果提示,仔猪肝脏Hsp70、Hsp90及Hsp27蛋白表达量受断奶日龄影响显著。     

牛分枝杆菌FixB、HspX和MPB83基因的原核表达及鉴定

为了给原核表达牛分枝杆菌Fix B、Hsp X和MPB83基因并纯化Fix B、Hsp X和MPB83蛋白,进一步研究它们在牛结核病诊断中作为特异性抗原的诊断价值及应用奠定基础,试验用PCR方法从牛结核分枝杆菌AF2122/97基因组中扩增出Fix B、Hsp X和MPB83基因片段,构建p ET-28a-Fix B、p ET-28a-Hsp X和p ET-28a-MPB83重组质粒,克隆到DH5ɑ感受态细胞,提取测序正确的阳性重组质粒,转化BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG于37℃诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式,Western-blot分析鉴定并用Ni-NTA层析柱纯化蛋白。结果表明:成功扩增了大小依次约为957 bp、435 bp和663 bp的Fix B、Hsp X和MPB83基因,将其连接p ET-28a原核表达载体,原核表达的Fix B、Hsp X和MPB83重组蛋白均以包涵体形式存在,分子质量依次约为37 ku、21 ku和28 ku。经Western-blot鉴定表达产物为Fix B、Hsp X和MPB83重组蛋白,Ni-NTA成功洗脱出目的蛋白。说明试验成功构建了牛分枝杆菌Fix B、Hsp X和MPB83基因的原核表达载体,并纯化了Fix B、Hsp X和MPB83重组蛋白,可用于进一步的应用研究。     

来航鸡FOXL2基因的克隆与原核表达

根据GenBank已发表的红色原鸡FOXL2基因序列(登录号NM_001012612.1)设计引物,以来航鸡全血为模板,PCR扩增出其基因全长编码区,经BamHⅠ-HindⅢ双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-FOXL2重组原核表达载体.将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)通过0.5 mmol/L IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为37 000,与预期表达蛋白大小一致.Western blotting检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白.为进一步探索该基因的生物学功能奠定了基础.     

热休克蛋白27在病毒感染中的作用研究进展

热休克蛋白27(Hsp27)是一种结构上高度保守的小热休克应激蛋白,具有多重生物学功能,在调节蛋白质稳态以维持细胞骨架有至关重要的作用。近年来,热休克蛋白(HSPs)在疾病预防和药物开发中取得较大突破,有研究发现在许多病毒感染宿主细胞后,细胞中Hsp27的表达会发生显著变化,表明Hsp27与病毒感染之间有密切关联,但Hsp27在病毒感染中的应用尚不成熟。论文主要介绍病毒感染宿主细胞后,Hsp27通过抑制细胞的自噬、凋亡、干扰素形成及维持病毒复制等发挥其在病毒感染中作用,此方面研究为以HSPs为靶点研发抗病毒药物提供了新思路。     

山羊支原体肺炎亚种Hsp70基因克隆与序列分析

山羊传染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolum subsp.Capripneumoniae,Mccp)引起的高度接触性传染病,热休克蛋白Hsp70,在Mccp所有蛋白翻译后功能和结构的表达起作用。以Mccp中国分离株87001为模板,扩增了Hsp70的全序列,将该序列克隆到pMD18T载体上并测序。将序列与其它已知动物支原体的Hsp70序列进行分析比较。测序结果87001株Hsp70基因全长1773bp,编码591个aa,第631～633位TGA在支原体编码色氨酸而不是作为终止密码子。将该序列与多种致病支原体Hsp70基因进行分析比较,发现87001株Hsp70基因与山羊支原体山羊亚种(Mcc)、丝状支原体丝状亚种SC的DNA同源性为99.3%～99.4%,氨基酸同源性为99.2%～99.3%,而与非同种支原体猪肺炎支原体232株等Mhp菌株的DNA和氨基酸同源性仅为64.5%～74.4%和59.3%～77%。这表明DnaK基因在种内高度保守,种间差异较大。原核表达得到大小为41Kd的目的蛋白,经Westernblot证实,纯化蛋白可与Mhp阳性猪血清反应,具有免疫活性。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因的克隆、表达及其免疫活性研究

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34 kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc.GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测.结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应.OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础.     

马立克氏病病毒６４８株囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达的研究

根据马立克氏病病毒（ＭＤＶ）强毒株ＧＡ的基因序列，设计和合成一对引物，以特超强毒６４８株基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ技术，扩增其囊膜糖蛋白gI基因阅读框（ＯＲＦ）中，除去其Ｎ－端编码疏水区的１６５个碱基对（bp)以外的蓁部分；将ＰＣＲ产物按正确的阅读框架定向克隆到表性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因的下游，将重组质粒转化进大肠杆菌ＢＬ２１株，在１．０mMIPTG浓度和３０℃的条件下诱导，gI-GST基因融合蛋白获得了理想的表达；经聚丙烯酰胺凝脉电泳，West-ern-blot试验，通信班下其表达的融合蛋白产物大小为预期的６３ＫＤ。将表达产物回收后免疫小鼠，所得抗血清可与ＭＤＶ感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）在免疫荧光试验（ＦＡ）中呈细胞膜阳性染色。试验结果表明，在大肠杆菌中表达的６４８株ＭＤＶgI基因的融合蛋白产物保留了天然蛋白的某些抗原性。     

结核分支杆菌HSP65 DNA疫苗的制备和重组蛋白的原核表达

结核分支杆菌分子量为65ku的热应激蛋白(HSP65)是一种非常重要的抗原，为了研制结核病核酸疫苗，构建编码HSP65DNA，并将其分别克隆到原核和真核载体中进行了表达。以标准结核分支杆菌H37Rv基因组DNA为模板，用PCR法扩增出HSP65基因，经限制性内切酶消化后，插入真核表达栽体pJW4303中，获得重组质粒pJW-HSP65。同时将HSP65基因插入原核表达栽体pET-22b( )，获得重组质粒pET22b-HSP65。将pET22b-HSP65重组质粒转化大肠杆菌蛋白酶缺陷型菌株BL21(DE3)／PolysS，用IPTG诱导，进行蛋白表达。结果表明，经酶切鉴定和序列测定证实插入片断为目的基因HSP65，构建成功了真核重组质粒pJW-HSP65即可作为结核病DNA疫苗。经SDS-PAGE检验证明可以在大肠杆菌细胞中高效表达，将表达蛋白进行纯化，作为保护性结核杆菌抗原以便检测HSP65DNA疫苗的免疫效果。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达

以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 CFP10的成功表达为结核病诊断及重组疫苗的构建打下了基础     

副猪嗜血杆菌OMP P2基因的克隆与表达

利用已分离的菌株HB070412,根据NCBI上GenBank中的HPS序列（ZP_02477753）设计了1对引物,用PCR方法扩增了副猪嗜血杆菌外膜蛋白中的穿孔素前体蛋白P2基因（OMP P2）,并克隆到载体pMD18-T（T-Vec-tor）,序列测定结果表明OMP P2基因全长1 077bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与所报道的HPS OMPP2基因之间的核苷酸序列同源性为98.1%,氨基酸序列同源性为95.5%。用pGEX-6p-1构建了原核表达载体pGEX-P2,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的50%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约为65 000,Western blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。     

新孢子虫SRS2基因的克隆及原核表达

为构建表达新孢子虫重组蛋白SRS2原核表达系统,本研究以新孢子虫基因组为模板PCR扩增SRS2蛋白部分基因,获得大小约为998bp的目的片段,并克隆到大肠杆菌PET-32a载体中,IPTG诱导重组大肠杆菌,通过SDS—PAGE和免疫印迹分析表达产物并鉴定其生物学活性。经SDS—PAGE分析,表达的重组SRS2蛋白分子量约为54kD,免疫印迹结果表明,表达的重组蛋白与牛抗新孢子虫阳性血清反应形成一条特异性蛋白条带。本实验为进一步研究诊断和治疗新孢子虫病奠定了基础。     

大肠埃希菌K88ac菌毛蛋白亚基因的原核表达及其免疫原性研究

从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体形式获得高效表达.Western blot结果显示,表达的蛋白能够被K88ac单抗识别,用纯化的蛋白免疫小鼠,能够抵抗1 MLD大肠埃希菌强毒株C83902的攻击,这表明构建的工程菌株XL1-Blue(pQE30-K88ac)可以作为预防幼畜大肠埃希菌性腹泻基因工程菌苗的候选株.     

禽分枝杆菌副结核亚种hsp65与鹅副黏病毒HN融合基因真核表达载体的构建与表达

为探索禽分枝杆菌副结核亚种（MAP）的热休克蛋白65（hsp65）对鹅副黏病毒（GPMV）血凝素神经氨酸酶（HN）的分子佐剂作用及构建GPMVDNA疫苗,针对GPMV的HN基因和MAP的hsp65基因设计引物,PCR克隆扩增两个基因,分别将二者先后与真核表达载体pVAXl连接,构建了pVAXl-HN、pVAXl-hsp65-HN,并通过PCR、酶切和序列鉴定所获重组质粒;应用脂质体法将其转染至Marc-145细胞,RT-PCR和间接免疫荧光试验证实hsp65和HN在Marc-145细胞中获得了表达。本研究为制备新型GPMVDNA疫苗及探索hsp65在DNA疫苗中的应用奠定了基础。     

表达绿色荧光蛋白的鸭肠炎病毒gE基因转移载体构建

本实验利用PCR方法扩增DEVC-KCE株gE基因片段(包含gI基因及其侧翼序列),扩增产物克隆入pGEM-T载体测序后亚克隆至pUC19 EcoRI、SalI位点间,获得pUC-gE。将增强型绿色荧光蛋白表达盒插入pUC-gE BamHI位点,构建转移载体pUC-gE-EGFP。该转移载体有7个单一酶切位点可供外源基因插入,上下游侧翼分别为1.57Kb和1Kb。将转移载体pUC-gE-EGFP转染鸭胚成纤维细胞(DEF),观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得有效表达,为开发以鸭肠炎病毒为载体的多价、多联基因工程疫苗提供了物质基础。