兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OMPH1基因的克隆及原核表达

本试验旨在克隆和表达兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OMPH1基因,并对其表达产物的反应原性进行研究。以兔多杀性巴氏杆菌C51-2-499株总DNA为模板,进行外膜蛋白基因OMPH1的PCR扩增,得到了1条大小为1 041 bp的基因片段,克隆至pMD-18T中。测序分析证明,它与国内外报道的多杀性巴氏杆菌OMPH1基因的核苷酸序列相似性达99%以上。将该基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,经酶切和测序分析表明,重组表达载体pET-30a(+)-OMPH1构建成功。将此重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。SDS-PAGE检测结果证实,该基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式得到表达,表达产物的分子质量约47KD,与预期的结果一致。Western-blot分析表明,OMPH1重组表达蛋白具有反应原性,可被兔多杀性巴士杆菌阳性血清识别,为兔多杀性巴氏杆菌基因重组疫苗及新型诊断试剂的研究奠定了基础。     

多杀性巴氏杆菌PurF蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为了获得多杀性巴氏杆菌PurF蛋白及其多克隆抗体,通过PCR扩增了多杀性巴氏杆菌C51-17株purF基因,将其克隆到表达载体pPROEX-HTa中,构建重组表达质粒pHT-PurF,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测表明,获得重组蛋白分子质量约56.5ku,主要以包涵体形式存在;Western blot检测表明,表达的蛋白可与多杀性巴氏杆菌制备的高免血清发生特异性反应。将制备的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测血清抗体效价,结果显示制备的多克隆抗体滴度达到1∶128 000,Western blot表明可与多杀性巴氏杆菌PurF蛋白发生反应。本研究制备了多杀性巴氏杆菌的PurF蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究PurF蛋白在多杀性巴氏杆菌致病中的作用奠定了基础。     

牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H的表达与纯化

试验对多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H(OmpH)基因进行克隆、鉴定,并在原核系统中表达。以多杀性巴氏杆菌(CVCC448)强毒株基因组为模板,扩增OmpH基因,连接T载体,经测序鉴定正确后与表达载体pET-28a连接构建重组表达质粒OmpH-pET28a,将此重组质粒转化入表达宿主E.coli BL21菌株内,抽提质粒,酶切鉴定正确后对转化菌株以IPTG进行诱导,表达产物通过镍离子亲和层析纯化,之后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,OmpH基因的编码区为978 bp,编码326 个氨基酸残基,融合蛋白分子质量约为37 ku。Western blotting检测结果显示,表达的重组蛋白OmpH可与鼠抗多杀性巴氏杆菌全菌体多抗血清反应得到清晰的目的条带,表明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。多杀性巴氏杆菌OmpH基因的成功表达,为进一步研究其免疫作用奠定了基础。     

鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的表达及抗原性鉴定

为了对多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H(OmpH)的免疫学活性进行鉴定,本研究根据已发表的Pm70株序列(AE004439)设计了两对引物,用PCR方法扩增了鸭多杀性巴氏杆菌C48-102株的Omp H,扩增片段为1180bp(ORF为1056bp)。Omp H与GenBank中登录的C44-1、P-1059、P52、X-73、PM-70、serogroup D的序列比对结果表明:Omp H在核苷酸水平上同源性为82.8%～99.2%;在氨基酸水平上同源性为82.1%～99.1%。扩增去信号肽的Omp H基因,构建了原核重组表达质粒pHT-Omp H,转化BL21并诱导表达,SDS-PAGE结果表明:表达蛋白约为41ku,与预期的分子量大小相符;western blot结果表明具有良好的免疫学活性,这为以重组OmpH蛋白建立针对鸭Pm的血清学检测方法奠定了基础。     

羊源多杀性巴氏杆菌sodA基因的克隆、表达及其生物信息学分析

为了解羊源多杀性巴氏杆菌超氧化物歧化酶(SOD)的生物学功能,本试验对该菌sodA基因进行克隆及原核表达,并对克隆的sodA基因进行遗传进化树分析,对其表达的SOD蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中多杀性巴氏杆菌HN06株基因组中sodA基因序列信息设计引物进行PCR扩增,将产物与pET-28a(+)载体相连,构建pET-28a(+)-sodA重组质粒,将该质粒转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆,再转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞进行表达,经IPTG诱导后对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,本试验成功扩增出大小为645bp的目的片段,并表达出大小约28ku的目的蛋白。遗传进化树分析表明,该基因与HN07(GenBank登录号:CP007040.1)和Pm70(GenBank登录号:AE004439.1)株亲缘关系较近,重组蛋白生物信息学分析显示,该融合蛋白为稳定的酸性亲水可溶性蛋白,分子式为C1085H1651N293O309S9,分子质量为24 032.36u,理论等电点为6.19,消光系数为45 170,不稳定系数为26.87(40),在哺乳动物网织红细胞的半衰期预计为30h,疏水指数为82.15,总平均疏水性(GRAVY)为-0.282,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。以上研究结果为后续深入研究多杀性巴氏杆菌在羊体内的存活机制及研发预防巴氏杆菌病的疫苗提供了参考。     

猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌毒素基因的原核表达

参照GenBank收录的产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因序列(AF240778),设计一对引物,从猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌中扩增出toxA编码区3 858 bp的片段,将其克隆至原核表达载体PET-32a,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行融合表达多杀性巴氏杆菌毒素。SDS-PAGE和Western blot分析证实,该表达产物以包涵体形式存在,大小约175 ku。动物试验结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性、反应原性及一定的生物学活性。通过间接ELISA方法检测抗毒素的猪阳性血清,表达重组蛋白较天然蛋白具有更高的特异性,为多杀性巴氏杆菌毒素进一步应用奠定了基础。     

多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及生物信息学分析

本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a(+)-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1 044 bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a(+)-OmpA重组菌最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,表达的重组蛋白大小约为40 ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40 ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C_(1684)H_(2619)N_(457)O_(505)S_3,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。     

羊源多杀性巴氏杆菌sodA基因的克隆、表达及其生物信息学分析

为了解羊源多杀性巴氏杆菌超氧化物歧化酶（SOD）的生物学功能,本试验对该菌sodA基因进行克隆及原核表达,并对克隆的sodA基因进行遗传进化树分析,对其表达的SOD蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中多杀性巴氏杆菌HN06株基因组中sodA基因序列信息设计引物进行PCR扩增,将产物与pET-28a（+）载体相连,构建pET-28a（+）-sodA重组质粒,将该质粒转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆,再转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞进行表达,经IPTG诱导后对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,本试验成功扩增出大小为645 bp的目的片段,并表达出大小约28 ku的目的蛋白。遗传进化树分析表明,该基因与HN07（GenBank登录号：CP007040.1）和Pm70（GenBank登录号：AE004439.1）株亲缘关系较近,重组蛋白生物信息学分析显示,该融合蛋白为稳定的酸性亲水可溶性蛋白,分子式为C₁₀₈₅H₁₆₅₁N₂₉₃O₃₀₉S₉,分子质量为24 032.36 u,理论等电点为6.19,消光系数为45 170,不稳定系数为26.87（<40）,在哺乳动物网织红细胞的半衰期预计为30 h,疏水指数为82.15,总平均疏水性（GRAVY）为-0.282,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。以上研究结果为后续深入研究多杀性巴氏杆菌在羊体内的存活机制及研发预防巴氏杆菌病的疫苗提供了参考。     

重组牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌脂蛋白E的免疫保护性研究

为鉴定多杀性巴氏杆菌脂蛋白E的免疫保护性,本研究从牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌PM-HLJ株的基因组DNA中扩增出大小为1 011 bp的脂蛋白E编码基因(PlpE),经序列测定显示,其氨基酸序列与A型多杀性巴氏杆菌参考株PlpE序列一致性为95.83%。将PM-HLJ的PlpE基因克隆于表达质粒pET-30a(+)并诱导表达,将表达的重组脂蛋白E纯化后经腹腔免疫小鼠,间接ELISA检测结果显示各免疫组均产生了针对重组脂蛋白E的IgG抗体,免疫保护试验显示,当小鼠免疫剂量为20μg、30μg、40μg和60μg时,保护率分别达到20%、40%、80%和100%。结果表明,牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌重组脂蛋白E具有良好的免疫保护作用。     

兔多杀性巴氏杆菌16S rRNA PCR检测方法的建立和应用

以兔多杀性巴氏杆菌的高度保守的16S rRNA为靶基因,参考已公布的多杀性巴氏杆菌的16SrRNA基因设计1对特异性引物,优化PCR反应条件,建立了兔多杀性巴氏杆菌PCR快速检测方法。该PCR方法的敏感性达到60cfu/mL,使用建立的PCR方法扩增兔多杀性巴氏杆菌标准株和分离株均能扩增出643bp的目的片段,扩增兔大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌结果为阴性,证明本试验所建立的兔多杀性巴氏杆菌病原PCR检测方法敏感、特异、可靠。     

多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及生物信息学分析

本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a （+）-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1 044 bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a （+）-OmpA重组菌最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,表达的重组蛋白大小约为40 ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40 ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C₁₆₈₄H₂₆₁₉N₄₅₇O₅₀₅S₃,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因真核、表达载体的构建

应用限制性内切酶BαmHⅠ将片段ompH从重组质粒pMDT—ompH切下，非定向插入真核表达质粒pcDNA3中，经酶切分析、PCR鉴定及序列测定，证实成功构建了禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因的重组真核表达质粒pcDNA3-omp H。将重组表达质粒转染至COS7细胞，经RT—PCR、SDS-PAGE及Western-blotting检测，证明了外膜蛋白H基因获得了瞬时表达。     

羊源多杀性巴氏杆菌toxA-N基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在对羊源多杀性巴氏杆菌toxA-N基因进行克隆、原核表达及纯化,并对表达蛋白toxA-N进行生物信息学分析,为探索羊源多杀性巴氏杆菌毒素基因的相关特性提供参考依据。以羊源多杀性巴氏杆菌基因组为模板,参考GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌HN06中toxA基因序列(登录号:CP003313.1)设计引物,通过PCR技术扩增出目的片段,构建重组质粒pET28a(+)-toxA-N,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达后,经考马斯亮蓝染色及Western blotting鉴定,纯化蛋白并运用生物信息学软件对表达蛋白进行特性分析。结果显示,试验成功扩增出大小为1 515bp的toxA-N基因片段,经BamHⅠ和NotⅠ双酶切得到大小约为5 369和1 515bp两条片段,表明成功构建了pET28a(+)-toxA-N重组质粒,IPTG诱导表达的菌株经考马斯亮蓝染色及Western blotting鉴定后,成功表达出大小约为60ku的toxA-N蛋白;生物信息学分析表明,toxA-N蛋白为包涵体,其分子式为C2635H4002N664O797S17,原子总个数为8 115,消光系数为84 480,不稳定指数为43.50,亲水性平均值为-0.381。在toxA-N蛋白二级结构中,α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲分别占53.47%、2.77%、11.28%和32.48%,与三级结构预测结果一致。本试验通过对toxA-N基因的初步研究,揭示了多杀性巴氏杆菌毒素的相关特性,对家畜的疾病预防、诊断、治疗具有重要意义。     

牛源多杀性巴氏杆菌PlpE蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为体外表达牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)PlpE基因及制备抗PlpE蛋白多克隆抗体,根据PlpE基因核酸序列设计了1对特异性引物,通过PCR扩增PlpE基因,构建重组质粒pET-32a-PlpE;摇菌提取质粒,进行双酶切鉴定,鉴定正确后将重组质粒pET-32a-PlpE转化至BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG进行诱导,对诱导蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定;使用纯化蛋白PlpE免疫北京大耳白兔,制备多克隆抗体,并进行间接ELISA和Western Blot分析。结果显示,扩增的PlpE基因大小为1 050 bp,在原核细胞中诱导表达的PlpE蛋白约56 kDa。间接ELISA结果显示,所制备多克隆抗体效价可达1:512 000;Western Blot结果显示,所制备多克隆抗体反应性良好。PlpE蛋白的成功表达和多克隆抗体的成功制备,为下一步多杀性巴氏杆菌诊断方法的建立和疫苗研发奠定了基础。     

牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的筛选

为筛选牛源多杀性巴氏杆菌(Pm)交叉保护性抗原,本研究以A型Pm CQ2株基因组为模板,对其omp A、omp H、plp E、pm0979、P6和pfh B基因分别进行扩增,克隆于相应表达载体并进行原核表达,同时对表达产物进行纯化及western blot鉴定。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,分别测定其对2 LD50剂量的A型和B型Pm的攻毒保护效果。结果表明,重组蛋白r Omp A、r Omp H、r Plp E、r Pm0979、r P6和r Pfh B对A型Pm CQ2株的攻毒保护率分别为20%、60%、70%、40%、20%和10%,对B型Pm CVCC450株的攻毒保护率分别为0、30%、40%、20%、10%和0,表明重组蛋白r Plp E、r Omp H和r Pm0979可以针对不同血清型的Pm提供较好的交叉保护作用。本研究为牛源Pm新型疫苗的研制奠定了基础。     

牛分支杆菌热休克蛋白65基因的分子克隆和表达

以牛型分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增热休克蛋白65(Hsp65)基因,PCR产物经纯化与EcoRⅠ/SaⅠ双酶切后与经同样处理的原核表达载体pGEX-6P-1进行连接,转化感受态细胞BL21中,筛选和构建了原核重组表达质粒pGEX-H65,核苷酸序列测定验证其正确性.以1 Mol/LIPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,Hsp65基因表达的融合蛋白GST-H65裂解为两部分;即64 kD和22 kD,两个蛋白分子量相加与预测的86 kD(HsP60 kD GST26 kD)相符.牛分支杆菌热休克蛋白HSP65的成功表达为其功能的研究打下基础.     

鸭源鸡杆菌flfA基因的克隆表达及抗原性分析

用PCR方法从鸭源鸡杆菌中国分离株PDS-RZ-1-SLG中扩增flfA基因,并运用生物信息学软件分析鸭源鸡杆菌菌毛蛋白FlfA的二级结构、表面可及性与B细胞优势表位簇;将目的基因插入原核表达载体Pet28a(+),经PCR、酶切及测序鉴定成功构建重组表达质粒pET28a(+)-FlfA,然后转化到大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组质粒表达;SDS-PAGE和Western blot鉴定FlfA的表达及抗原性。结果显示:成功获得与预期大小一致的573bp的flfA基因;FlfA蛋白结构分析显示其二级结构以无规则卷曲为主,表面存在很多抗原表位;PCR及酶切等鉴定表明重组表达质粒pET28a(+)-FlfA构建成功。SDS-PAGE分析显示,经IPTG诱导表达获得相对分子质量约20 000的重组蛋白;Western blot分析结果显示重组菌毛蛋白能被兔抗rFlfA多抗血清和鸡抗鸭源鸡杆菌血清识别,抗原性良好;而且,rFlfA多抗血清与菌毛蛋白具有良好反应性。     

兔多杀性巴氏杆菌和兔出血症病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立兔多杀性巴氏杆菌(Pm)和兔出血症病毒(RHDV)的双重PCR检测方法，本研究根据Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域，设计2对特异性引物，经PCR分别扩增Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域，构建重组质粒p MD-Pm和p MD-RHDV，并经菌液PCR和测序鉴定后作为重组质粒标准品。经各反应条件优化后初步建立了检测Pm和RHDV的双重PCR方法。反应条件优化结果显示，该方法的最适退火温度为59℃，扩增kmt1和VP60基因的最优引物浓度均为0.5μL (10μmol/L)。对Pm和RHDV及其他病原包括兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种相关病原的特异性试验结果显示，除Pm和RHDV有特异性扩增条带外，其余相关病原均无扩增条带，特异性较强。将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后作为模板，经该双重PCR方法扩增。结果显示，该方法对p MD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL，对p MD-RHDV的检测限为1 260拷贝/μL，敏感性较高；对两种病原的DNA和cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致，重复性较好。对100份临床...     

多杀性巴氏杆菌转铁结合蛋白TbpA的原核表达及免疫原性

为研究多杀性巴氏杆菌转铁结合蛋白TbpA的免疫原性,本试验利用PCR从牛源A型多杀性巴氏杆菌HB01基因组中扩增了TbpA的编码基因tbpA,并将其克隆至原核表达载体pET-30α(+)上,转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示,rTbpA蛋白成功表达。Western blot证实该蛋白能够与抗多杀性巴氏杆菌HB01血清发生阳性反应。将rTbpA免疫小鼠后,分别于免疫后14,28 d采血,利用ELISA试验检测血清中的抗体滴度,结果显示血清中的抗rTbpA蛋白的IgG抗体显著升高(P0.05)。感染试验结果显示,免疫rTbpA蛋白能够保护70%的小鼠抵抗多杀性巴氏杆菌的致死性攻击,并且病理切片结果表明,免疫小鼠的肺部损伤相对于对照组小鼠显著降低。本试验为筛选新型的多杀性巴氏杆菌免疫原性蛋白提供依据。     

禽多杀性巴氏杆菌ompa基因在Vero细胞中的表达

利用PCR技术扩增出禽多杀性巴氏杆菌1 050 bp的ompa基因片段,克隆到pUCm-T载体上,再亚克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pCA(pcDNA3.1-OmpA),将该重组质粒体外转染Vero细胞,检测其转录和表达情况。结果表明重组质粒pCA构建成功,通过RT-PCR由转染了重组质粒的Vero细胞中扩增出了目的条带,间接免疫荧光试验分析表明在转染了pCA的Vero细胞中出现绿色荧光,Western blotting分析显示重组质粒pCA转染的Vero细胞泳道出现约37.5 ku的特异条带,说明ompa基因在Vero细胞中成功表达了活性蛋白,从而为进一步研究禽多杀性巴氏杆菌ompa DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。