O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT-PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET-32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础．经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western—blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好．     

O型口蹄疫病毒代表性抗原VP1基因的人工合成与表达及其免疫原性检测

通过对GenBank近10年内收录的O型口蹄疫(FMD)病毒 VP1基因序列的同源性比较分析,并根据中国、老挝、缅甸等国家FMDV流行毒株的基因序列,设计并合成了有群内抗原代表性的结构蛋白VP1全基因序列.将合成的序列克隆到原核表达载体pET-28a( )中,构建了VP1的表达质粒pETVP1.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG诱导下可特异性表达VP1蛋白,该重组蛋白以包涵体的形式存在,相对分子质量约30 000,能与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生特异性反应.动物接种试验表明,重组蛋白能诱导小白鼠产生特异性抗FMDV抗体.     

O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP1的克隆与原核表达

[目的]为进一步研究口蹄疫病毒的诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上已公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至表达载体pGEX-6p-1中,经测序鉴定目的基因正确地整合至表达质粒中,用IPTG诱导重组基因表达。[结果]通过PCR扩增获得682 bp的目的片段,所克隆的VP1基因在原核细胞中成功表达,表达产物为融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定分子量为51 kD,Western Blot结果表明融合蛋白具有免疫原性。[结论]获得了猪O型口蹄疫VP1融合蛋白,可作为包被抗原用于口蹄疫诊断试剂盒的研制。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测(英文)

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33Ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1-2A基因及多表位片段在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统串联表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因及O型FMDV多表位片段(CTE),将O型FMDVvp1基因和CTE多表位片段克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-VP1-2A-CTE并测序。经SalI线性化后,通过电击转化法将重组质粒导入毕赤酵母GS115中,并对表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组质粒通过电转进入毕赤酵母后,能表达相对分子量为41.8KD(CTE)和26.5KD(VP1-2A)的蛋白,经Western blot分析,两种蛋白均具有抗原性。在毕赤酵母中成功地表达O型FMDVVP1-2A蛋白和多表位片段(CTE),为研制新型口蹄疫的基因工程疫苗奠定了基础。     

嵌合型口蹄疫病毒样颗粒组装研究

[目的]为研究和制备多联或多价口蹄疫病毒样颗粒疫苗奠定基础.[方法]将FLAG序列通过融合PCR技术插入口蹄疫结构蛋白VP1GH-loop可变区,并通过大肠杆菌原核表达技术表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1,在体外组装出嵌合FLAG外源多肽的口蹄疫病毒样颗粒.[结果]大肠杆菌表达的口蹄疫衣壳蛋白主要以可溶性存在,在缓冲体系中融合标签被切除衣壳蛋白VP0、VP3和FLAGVP1组装成病毒样颗粒,其大小约25 nm左右.FLAG序列成功插入GH-loop可变区第150-151氨基酸位点之间,外源多肽的插入没有影响衣壳蛋白VP1的空间结构.[结论]口蹄疫loop可变区引入外源抗原是可行的,但外源多肽的大小及理化性质会影响病毒样颗粒的组装效率.     

C型口蹄疫病毒型特异性抗原的表达与鉴定

[目的]为C型FMDV型特异性多克隆抗体、单克隆抗体的制备及FMDV定型提供理论依据。[方法]以含有C型口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白基因VP1的重组质粒pGEM—CP1为模板,设计特异性表达引物,扩增VP1及其C端编码区。对C型口蹄疫病毒VP1及其C端进行原核表达,并测定反应原性。利用纯化的C型VP1及其C端融合蛋白建立间接ELISA,分别对O、A、C、Asia14型豚鼠阳性血清进行检测,确定C型VP1及其C端与其他3型FMDV抗体的型间交叉反应性。[结果]构建了pPRO-CVP1、pPRBO-CVP1c重组原核表达质粒,实现了C型口蹄疫病毒VP1及其C端的高效表达,目的蛋白的分子量大小分别为33和20kD。Westernblot显示。VPl及其C端融合蛋白均可与对应血清型的豚鼠阳性血清反应。C型VP1及其C端与其他血清型的FMDv阳性血清均未发生交叉反应。且以VP1c端的型特异性最好。[结论]获得了C型FMDV特异性抗原。     

口蹄疫病毒VP1蛋白可溶性表达标签筛选

为了提高口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,根据A型口蹄疫病毒核酸序列设计并合成了口蹄疫病毒VP1片段,将其克隆到p ET21b(+)载体上,设计1对通用引物扩增10个融合标签Grifin、GST、Nus A、SUMO、Thioredoxin、Protein G、γ-crystallin、Ars C、Ppi B、MBP,并分别将扩增的融合标签与VP1连接构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导其表达。SDS-PAGE结果表明,MBP、Grifin和GST能够促进口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,其中MBP与VP1融合表达蛋白可溶部分占60%;Western blot鉴定分析结果显示,小鼠抗His标签单克隆抗体能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了具有免疫学活性的融合蛋白MBP-VP1。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测李

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。     

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。     

兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性

[目的]研究兔出血症病毒（RHDV）VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b（＋）为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。     

鸭病毒性肝炎病毒VP3基因的克隆与表达

提取鸭肝炎病毒RNA作为模板,进行RT-PCR扩增,得到723 bp的VP3基因,将纯化的VP3基因片段与pMD18-T载体进行连接,构建DHVVP3基因克隆重组质粒。然后定向插入到pET-32a(+)表达载体,筛选获得原核表达载体pET-32a-VP3。用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,VP3蛋白得到正确表达,其分子量为47.1 ku,表达的蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应。     

C型口蹄疫病毒型特异性抗原的表达与鉴定

[目的]为C型FMDV型特异性多克隆抗体、单克隆抗体的制备和FMDV定型提供理论依据。[方法]以含有C型口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白基因VP1的重组质粒pGEM—CP1为模板,设计特异性表达引物,扩增VP1及其c端编码区。对C型口蹄疫病毒VP1及其c端进行原核表达,并测定反应原性。利用纯化的C型VP1及其C端融合蛋白建立间接EHSA,分别对0、A、C、Asia1四型豚鼠阳性血清进行检测,确定C型VP1及其C端与其他3型FMDV抗体的型间交叉反应性。[结果]构建了pPR0-CVP1、pPR0-CVP1c重组原核表达质粒,实现了C型口蹄疫病毒VP1及其C端的高效表达,目的蛋白的分子量大小分别为33kD和20kD。Westernblot显示,VP1及其C端融合蛋白均可与对应血清型的豚鼠阳性血清反应。C型VP1及其C端与其他血清型的FMDV阳性血清均未发生交叉反应,且以VP1C端的型特异性最好。[结论]获得了C型FMDV特异性抗原。     

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.     

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。     

口疮病毒O2O基因的克隆、表达及多抗制备

羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病.O2O基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白.根据GenBank中O2O基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因.然后将其亚克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET-32a-ORF-020.鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达.表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析.最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清.SDS-PAGE结果表明,ORFV O2O基因在体外获得正确表达,大小约37 kDa.Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与O2O蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性.     

水稻L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆和原核表达及抗体的制备

应用RT-PCR技术从水稻叶片中克隆了水稻L-半乳糖内酯脱氢酶(GLDH)的全长基因.序列分析表明,水稻GLDH基因全长1752bp,亚克隆其部分成熟蛋白编码基因(789bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET30a-GLDHe,经酶切鉴定,DNA测序,证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析证实表达出相对分子质量约为36000的蛋白.用原核表达蛋白作为抗原免疫家兔制备抗体,用Westernblot检测抗体的特异性及效价,结果表明,抗体血清效价为1∶1000,在加IPTG诱导后的菌液中可以检测到相应的蛋白条带((相对分子质量为36000)),在水稻叶片样品中能检测到1条相对分子质量为36000的蛋白条带.     

基因C型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备(

采用RT-PCR方法,扩增基因C型DHV JFX08株的VP1基因,与pMD18-T载体进行连接,构建新型DHV VP1基因克隆重组质粒。然后将VP1基因定向插入到pET-32a(+)表达载体中,筛选原核表达载体pET-32a-VP1,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明,基因C型DHV-VP1基因可在大肠杆菌中稳定高效的表达。Western-blot检测表明,表达产物可与基因C型DHV阳性血清发生特异性反应。将纯化的重组蛋白免疫4周龄SPF鸡,以纯化的VP1重组蛋白和基因C型DHV全病毒分别包板,制备的抗血清ELISA效价分别可达1∶25 600,1∶51 200,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体,根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出M基因,克隆入原核表达载体p ET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,Western blot分析显示,制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,M基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。     

恶性疟原虫肝素结合蛋白质PF3D7_1104400的原核表达与多克隆抗体的制备

为研究肝素结合蛋白质PF3D7_1104400的功能以及其作为疟疾疫苗候选抗原的可行性,通过PCR方法扩增目的基因,并将其与p ET-28a和p GEX-4T-1表达载体连接构建重组表达质粒。将构建成功的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21-Condon Plus(DE3)-RIPL中诱导表达,利用亲和层析的方法纯化His-tag和GSTtag重组蛋白质。用His-tag重组蛋白质免疫家兔制备多克隆抗体,以该抗体为一抗,利用Western blot检测该抗体的特异性以及PF3D7_1104400蛋白质在虫体内是否表达。结果表明:成功构建重组表达质粒PF3D7_1104400-p ET和PF3D7_1104400-p GEX,诱导表达并纯化出特异性好、纯度高的重组蛋白。制备的多克隆抗体能够特异性识别虫体天然蛋白,PF3D7_1104400蛋白质在恶性疟原虫体内全长表达。