C型口蹄疫病毒型特异性抗原的表达与鉴定

[目的]为C型FMDV型特异性多克隆抗体、单克隆抗体的制备和FMDV定型提供理论依据。[方法]以含有C型口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白基因VP1的重组质粒pGEM—CP1为模板,设计特异性表达引物,扩增VP1及其c端编码区。对C型口蹄疫病毒VP1及其c端进行原核表达,并测定反应原性。利用纯化的C型VP1及其C端融合蛋白建立间接EHSA,分别对0、A、C、Asia1四型豚鼠阳性血清进行检测,确定C型VP1及其C端与其他3型FMDV抗体的型间交叉反应性。[结果]构建了pPR0-CVP1、pPR0-CVP1c重组原核表达质粒,实现了C型口蹄疫病毒VP1及其C端的高效表达,目的蛋白的分子量大小分别为33kD和20kD。Westernblot显示,VP1及其C端融合蛋白均可与对应血清型的豚鼠阳性血清反应。C型VP1及其C端与其他血清型的FMDV阳性血清均未发生交叉反应,且以VP1C端的型特异性最好。[结论]获得了C型FMDV特异性抗原。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达、纯化及鉴定

[目的]通过原核表达及纯化获得A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1,为建立A型FMDV的ELISA诊断方法及开发安全、高效、广谱的新型基因工程疫苗提供技术支持.[方法]以含A型FMDV VP1基因的重组质粒pMD18-T-A-VP1为模板,通过特异性引物扩增A型FMDV的VP1基因,构建表达质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1,然后转入感受态细胞E.coli BL21 (DE3)中诱导表达融合蛋白.[结果]诱导表达获得的VP1融合蛋白主要以包涵体形式存在,分别经His· Bind和GST· Bind柱层析纯化,SDS-PAGE分析结果表明融合蛋白纯度较高;Western blotting检测分析发现,VP1融合蛋白能与豚鼠抗A型FMDV阳性血清发生特异性结合,但不与豚鼠抗O型和Asia1型FMDV阳性血清反应.[结论]经原核表达及纯化获得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特异性和抗原性,可用于易感动物的免疫及血清抗体筛查.     

O型口蹄疫病毒VP1基因及其多表位基因的原核表达与纯化鉴定

[目的]通过原核表达并纯化获得O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因及其多表位基因的重组蛋白,为建立O型FMDV抗体ELISA检测试剂盒及制备动物高免血清提供技术支持.[方法]以O型FMDV VP1全基因重组质粒pMD18-T-T-VP1及串联的ⅥP1多表位基因重组质粒pMD 18-T-O-VP1为模板,通过特异性引物扩增并回收目的基因,构建重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1,然后转入大肠杆菌BL211 (DE3)中诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行分析鉴定.[结果]O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到正确表达,表达的两种融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯度较高,且均能与猪抗O型FMDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性.[结论]表达获得的融合蛋白具有良好的反应原性,可作为包被抗原应用于O型FMDV抗体检测试剂盒研发.     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测(英文)

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33Ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测李

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒代表性抗原VP1基因的人工合成与表达及其免疫原性检测

通过对GenBank近10年内收录的O型口蹄疫(FMD)病毒 VP1基因序列的同源性比较分析,并根据中国、老挝、缅甸等国家FMDV流行毒株的基因序列,设计并合成了有群内抗原代表性的结构蛋白VP1全基因序列.将合成的序列克隆到原核表达载体pET-28a( )中,构建了VP1的表达质粒pETVP1.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG诱导下可特异性表达VP1蛋白,该重组蛋白以包涵体的形式存在,相对分子质量约30 000,能与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生特异性反应.动物接种试验表明,重组蛋白能诱导小白鼠产生特异性抗FMDV抗体.     

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。     

口蹄疫病毒3D蛋白C端Th表位的重组表达及免疫功能鉴定

为获得含有口蹄疫病毒( foot and mouth disease virus,FMDV)3D蛋白C端多个Th表位的重组表达蛋白，根据口蹄疫3D C端160个氨基酸序列，设计优化并人工合成相应的核酸序列，将其克隆至pET28a，构建原核表达质粒pET28a C160，并将重组质粒转化BL21(DE3)，0.5 mmol/L IPTG诱导后，收集菌液进行SDS PAGE和Western blot鉴定。结果显示，在25 ku处有一条明显的蛋白表达条带，且重组蛋白能与豚鼠抗O型口蹄疫病毒阳性血清发生特异性反应。对表达产物进行可溶性分析，结果显示，表达蛋白全部以包涵体形式存在，经变复性后获得较高质量浓度的纯化蛋白。可见：用纯化的3D C160蛋白作为Th佐剂与口蹄疫主抗原混合制成疫苗，免疫后能刺激猪体产生较高水平的口蹄疫抗体。     

Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备

[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒（FMDV）的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a（＋）质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5120。[结论]该研究结果为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒O型病毒VP1蛋白表达及鉴定

利用大肠杆菌p ET-30a表达系统表达口蹄疫病毒(FMD)O型野毒株完整的VP1蛋白,并以Western blot试验进行鉴定。结果表明:VP1蛋白以可溶性表达,大小约为25 ku,可与标准O型口蹄疫病毒阳性血清特异结合。由此说明,口蹄疫病毒VP1原核表达蛋白有良好的反应原性,为构建口蹄疫病毒病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)和快速特异诊断试剂研制奠定基础。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP1的克隆与原核表达

[目的]为进一步研究口蹄疫病毒的诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上已公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至表达载体pGEX-6p-1中,经测序鉴定目的基因正确地整合至表达质粒中,用IPTG诱导重组基因表达。[结果]通过PCR扩增获得682 bp的目的片段,所克隆的VP1基因在原核细胞中成功表达,表达产物为融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定分子量为51 kD,Western Blot结果表明融合蛋白具有免疫原性。[结论]获得了猪O型口蹄疫VP1融合蛋白,可作为包被抗原用于口蹄疫诊断试剂盒的研制。     

Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备

[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒（FM-DV）的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a（＋）质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE分析;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105 kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5 120,[结论]为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定

[目的] 研究口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定。[方法] 以含有FMDV 3ABC基因的质粒为模板,应用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因并进行序列测定,将3AB基因克隆至表达载体pET-28a（＋）,选取阳性克隆转化BL21感受态用IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-bolt检测分析。[结果] 经SDS-PAGE和Western-bolt分析表明,在大肠杆菌中成功表达了3AB蛋白,表达的目的蛋白能与FMDV阳性血清发生特异性反应。[结论] 该项研究为应用以重组FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫动物的鉴别诊断方法提供了依据。     

番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及鉴定

[目的]使番鸭细小病毒(DPV)VP3在原核表达系统中正确表达.[方法]根据番鸭细小病毒VP3基因序列,设计一对特异性引物,利用PCR技术扩增出VP3基因;将其克隆至原核表达载体p ET-32a,获得重组表达载体p ET-32a-VP3.将重组质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白.[结果]成功表达出与预期大小相符的重组蛋白,约89 k Da;且当IPTG浓度为1.2 mmol/L,诱导时间为6 h时蛋白表达量最大.[结论]该研究通过原核表达系统成功表达了DPV、VP3蛋白,并摸索了蛋白最佳表达条件.     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT-PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET-32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础．经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western—blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好．     

猪轮状病毒VP4蛋白基因在大肠杆菌中的表达

[目的]研究猪的轮状病毒VP4蛋白基因在BL21大肠杆菌中的表达。[方法]以猪肺脏组织中分离的总RNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应（1it—PCR）技术扩增VP4蛋白的部分基因,将PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒PGEX-4T-1-VP4并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。将重组载体PGEx4T-1-VP4转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达和SDS—PAGE分析,并对重组大肠杆菌进行可溶性分析。[结果]对猪肺脏组织中分离的总RNA进行RT—PCR扩增,获得875bp的VP4部分基因,重组质粒PGEX-4T-1-VP4经BamHI和Xho Ⅰ双酶切和测序鉴定后,插入的猪轮状病毒VP4的eDNA编码区序列与已公布的猪GenBank核酸序列比对结果为99．5％;将重组质粒pGEX-4T-1-VP4-一转化至大肠杆菌B121（DE3）中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约58kDa融合蛋白带。[结论]该研究为进一步研究轮状病毒的疫苗研制奠定了基础。