FMDV OA/58病毒株VP1蛋白结构构建与B细胞抗原表位的预测

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoR Ⅰ酶切法鉴定.运用同源模建得到OA/58 VP1蛋白3D结构,并结合理化性质、亲水性、可塑性和免疫原性进行分析,预测OA/58 VP1的抗原表位.结果 OA/58 VP1存在多个潜在的抗原表位位点,可能的蛋白质抗原表位区域:2～11,15～35,38～50,77～88,90～107,121～125,131～135,140～149,154～163,169～175,178～189,197～213.应用同源模建得到的OA/58 VP1蛋白3D模型来预测其B细胞表位,为进一步研究OA/58 VP1功能,构建突变体和选择表达新型OA/58 VP1蛋白分子提供有参考价值的信息.     

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白αvβ6的细胞定位及组织分布

利用pcDNA3.1（＋）-β6p真核表达载体稳定转染CHOK1细胞,间接免疫荧光法（IFA）检测整联蛋白αvβ6在转染细胞中的表达分布。以间接免疫组化法（IHA）检测整联蛋白αvβ6在健康猪舌、唇、气管等组织的表达分布。采用抗猪源整联蛋白β6亚基的单克隆抗体作为一抗,FITC标记山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG分别作为二抗。结果表明,pcDNA3.1（＋）-β6p真核表达载体稳定转染的CHOK1细胞的细胞膜及细胞质内可见致密的绿色荧光（IFA）,猪舌、唇、气管等组织细胞的细胞膜及细胞质内均出现了棕黄色的特异阳性反应物,表明整联蛋白αvβ6受体广泛分布于猪体的器官组织细胞中,为深入研究整联蛋白αvβ6在口蹄疫病毒感染过程中的作用奠定了基础。     

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体识别的抗原表位分析

[目的]分析测定口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体（mAb）的抗原识别位点、饱和值、亲和力常数。[方法]利用叠加ELISA法、间接ELISA法、硫氰酸盐洗脱法测定C2D8、B786、B8C9、CAC7、E7C75株mAb的抗原识别位点、饱和值、亲和力常数。[结果15株mAb间具有相似或不同的抗原识剐位点，其中C4C7与E7C7、C4C7与B8C9、E7C7与B8C9等mAb间的识别位点相似．而C4C7与B786、E7C7与C2D8等mAb间的识别位点不同。5株mAbC2D8、E7C7、B8C9、C4C7、B7B6的饱和值分别为1：200、1：400、1：800、1：800、1：800，亲和力为B8C9〉C4C7〉B7B6≥E7C7〉C2D8。[结论]分析测定了5株mAb的抗原识别位点、饱和值、亲和力常数，从而为利用mAb深入研究整联蛋白OtV[36在口蹄疫病毒感染过程中的作用奠定基础。     

1—2月龄荷斯坦奶牛不同组织中FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA转录水平的相对定量研究

【目的】建立检测牛口蹄疫病毒(FMDV)受体亚基αv、β3、β6 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析受体αvβ3和αvβ6在不同器官组织中的转录水平。【方法】在对牛FMDV受体基因克隆和测序的基础上,设计实时定量PCR引物,以GAPDH为内参基因,采用△△Ct相对定量PCR方法检测分析FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA在1—2月龄荷斯坦奶牛体内不同器官组织中的转录表达谱。【结果】αvβ3在荷斯坦奶牛24种组织中均有不同程度的转录表达;αvβ6在甲状腺、硬腭、鼻内皮、喉头、肺、食管、肾、后蹄冠状带等组织表达量较高,在唇、舌皮、软腭、气管、心脏、瘤胃、直肠、前蹄冠状带等组织转录表达量适中,在唾液腺、下颌淋巴结、肝、脾、肌肉等组织未检测到表达;αvβ6在牛体内的表达分布与FMDV组织嗜性基本一致,αvβ6受体可能是决定FMDV组织嗜性的主要功能受体,αvβ3的组织分布似乎与FMDV组织嗜性无关,但不能排除αvβ3在病毒感染过程中的作用。【结论】建立了检测FMDV受体亚基mRNA在不同器官组织中表达水平的相对实时定量PCR方法。     

FMDV OA/58病毒株VP3蛋白结构的模拟与分析

以口蹄疫病毒株OA／58 RNA为模板，反转录并扩增目的cDNA，然后与pMD18-T载体连接并转化JM109菌株，提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和BarnHⅠ、HindⅢ双酶切法鉴定。分析表明，口蹄疫病毒VP1、VP2、VP3和VP4在核苷酸水平上的变异率是无差异的（P〉0．05）；而它们在氨基酸水平上的变异率差异显著（P〈0．05）。该毒株与20株源于GenBank中的VP3氨基酸序列比较发现其保守区主要位于第1～24、26～35、37～43、45～57、61～122、124～173、175～209、211～220位。运用同源模建，OA／58 VP3蛋白三维空间结构可分为A，B，C3个结构区域。保守区氨基酸残基在维持VP3蛋白的空间构象和功能方面具有重要作用。     

口蹄疫OA／58病毒株VP2蛋白结构模拟与B细胞抗原表位的分析

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pMD18-T载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和BamH I,Hind III双酶切法鉴定。运用同源模建得到OA/58 VP2蛋白三维空间结构,并结合理化性质、亲水性、可塑性和免疫原性进行分析,找出OA/58 VP2蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,OA/58 VP2蛋白存在多个潜在的抗原表位,可能的蛋白质抗原表位区域:1~23,40~63,71~78,82~91,102~106,113~119,131~138,148~154,166~177,189~196,212~218。应用同源模建得到的OA/58 VP2蛋白三维空间结构来预测其B细胞表位,为进一步研究OA/58 VP2蛋白在引起易感宿主体液免疫应答方面提供了一种可视化的技术平台,并且为选择表达其他口蹄疫病毒株的VP2蛋白分子提供有参考价值的信息。     

利用Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白的单克隆抗体建立单抗竞争ELISA方法

应用纯化的Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白作为抗原，采用过碘酸钠法标记纯化的单抗，建立了单抗竞争ELISA，检测10份阳性猪口蹄疫血清及200多份阴性血清，试验结果与样品的背景相一致。敏感性试验和重复试验结果表明，该方法具有稳定和敏感等特性，适合Asia1型猪口蹄疫病毒抗体的监测。     

C型口蹄疫病毒鼠源毒株3A基因的克隆及序列分析

应用RT-PCR技术克隆获得了一株C型口蹄疫病毒鼠源毒株的非结构蛋白3A基因(C-3A),并对其进行序列测定及分析.结果表明,C-3A编码全基因序列中核苷酸共435 bp,编码氨基酸145个;与12株参考毒株比较发现,C型毒株核苷酸序列在第274~297位发生了缺失,氨基酸在92~99位发生缺失.核苷酸的同源性比较显示,C-3A基因与YNBS/58-3A基因的同源性最高,为82.8%;C-3A基因与TW/97-3A基因的同源性最低,为72.5%.氨基酸的同源性比较表明,C-3A基因与OIC/58-3A基因的同源性最高,为86.9%;与TW/97-3A基因的同源性最低,为72.7%.     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体轻链可变区的克隆及序列分析

应用分子生物学技术,从分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞9F12中提取总RNA,经反转录,PCR扩增及克隆,得到VL基因。序列测定结果表明,9F12的VL基因为336 bp,可编码112个氨基酸。用NCBI GenBank分析表明,VL基因符合小鼠抗体可变区特征,为功能性重排的抗体可变区基因。根据Kabat分类体系,9F12的VL基因片段隶属于抗体κ轻链20家族。9F12的VL基因的克隆为抗O型口蹄疫病毒单链抗体的构建与表达奠定了基础。