兔防御素cDNA表达质粒的构建及其表达

将兔防御素（MCP－1）cDNA插入真核表达载体pcDNA3的EcorRⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，构建了兔MCP－1cDNA的真核表达质粒pcDEF。通过脂质体转染，使兔MCP－1 cDNA在COS－7细胞中表达，在转染60、84、108h后，提取总RNA。采用RT－PCR，在288bp的位置扩增出1条特异性带；RNA斑点印迹杂交表明，兔MCP－1 cDNA在60、84、108h均有表达。     

用间接免疫荧光检测方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究

为用体外试验方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力,以猪瘟病毒抗体（兔源）为一抗、荧光素标记羊抗兔IgG 为二抗,建立了CSFV兔化弱毒株的间接免疫荧光检测方法（ IFA）。特异性试验表明,用该IFA方法检测CSFV兔化弱毒株接种的RK细胞为阳性,而检测伪狂犬病毒、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病毒接种的RK细胞均为阴性。 CSFV兔化弱毒株和活疫苗的兔体感染量（ RID）用兔体测定,半数组织感染量（ TCID50）用IFA测定,拟合RID与TCID50的线性回归方程,确定1RID/mL＝（ TCID50/0．1mL＋200）/12。     

口蹄疫病毒3D基因的真核表达及其表达产物的功能分析

利用RT—PCR技术扩增口蹄疫病毒（FMDV）编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因，经测序确认后将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）中，重组质粒pcDNA3．1（＋）-3D经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后转染至BHK-21细胞。用纯化的目的蛋白进行Western—blotting鉴定，并预测该3D基因表达产物的三级结构。结果显示，获得分子质量约55ku的单一3D基因表达产物，其三级结构较为保守。利用RNA细胞内复制体系和荧光定量RT-PCR技术，证明3D基因表达产物在细胞内可促进口蹄疫病毒基因组的复制。     

牦牛血液铜锌超氧化物歧化酶cDNA克隆测序

本试验从牦牛血液中提取总RNA,然后用AMV反转录酶对其进行反转录产生第一条cDNA链。根据奶牛Cu/Zn-SODcDNA序列（序列号：NM174615）设计一对PCR引物,对反转录后产生的第一条cDNA链进行PCR扩增,并克隆测序,测序结果为483bp。结果证实可从牦牛血液中提取到少量合成的铜锌超氧化物歧化酶的mRNA。     

稳定表达LamR的RK13细胞系的建立及RHDV吸附能力的初步研究

为建立稳定表达层黏连蛋白受体(LamR)RK13细胞系(RK13-LamR),并研究LamR蛋白在兔出血症病毒(RHDV)与宿主细胞结合中的作用,将完整的LamR序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-m Cherry,并将该重组质粒pLVX-m Cherry-LamR与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染RK13细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达LamR蛋白的RK13细胞。通过间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting证明所获细胞株能够稳定表达LamR蛋白,将细胞株命名为RK13-LamR。以纯化的RHDV接种RK13-LamR细胞,IFA检测结果显示,LamR蛋白能促进RHDV对RK13细胞的吸附。本研究建立了RHDV相对敏感的细胞株,证实在RHDV吸附宿主细胞的过程中,LamR蛋白起到一定的作用。     

亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因文库的构建及分析

从单雌蜱克隆群中挑选未吸血雌蜱60只，随机分成两组。未吸血组直接剖取唾液腺．半饱血组于蜱吸血第5d采集，分离唾液腺。Trizol法提取总RNA，经第一链合成、LD—PCR、RasⅠ酶切、接头连接和抑制消减杂交（SSH）等步骤，获得差异表达基因的cDNA片段。将纯化的cDNA片段与pGEMT—Easv我体连接，转化DH5a，获得204个白色菌落。扩增检查表明，136个克隆含有插入片段，片段大小为250bp-850bm，测出有效序列120个。由10个cDNA片段的RT—PCR检查结果初步断定，本研究消减效果良好。由网上资源分析得：21个片段与其他蜱的基因，19个片段与按蚊、库蚊、钩虫、奥斯特线虫等其他吸血寄生虫的基因，9个与果蝇的基因具有同源性。     

蜜蜂球囊菌全长cDNA文库的构建与分析

本试验利用TRIzol试剂盒提取蜜蜂球囊菌总RNA,通过Oligotex纯化试剂盒将mRNA反转录成cDNA,再以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA,该cDNA产物经分级分离和体外包装,即获得蜜蜂球囊菌cDNA原始文库,其滴度测定为1.6×106PFU/mL,扩增后的滴度是1.5×109PFU/mL;取适量扩增文库稀释并铺平板,蓝白斑筛选独立噬菌斑,用M13±通用引物进行PCR扩增后,文库的重组率达到90%,插入cDNA片段的长度在0.5~2 kb。该文库的构建,有利于筛选目的基因,便于深入研究蜜蜂白垩病的侵染机制,最终有效防制白垩病。     

兔出血症病毒VP60基因真核表达质粒的构建及初步评价

利用pMD18-T-VP60质粒（包含RHDVTP株VP60基因）PCR扩增并酶切回收VP60基因片段,插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中,构建真核表达质粒pcDNA—VP60,对重组质粒进行酶切和PCR鉴定;将重组质粒转染RK13细胞,进行间接免疫荧光和Western-blot检测;将构建好的重组质粒作为核酸疫苗,腿部肌肉注射免疫小鼠,采用间接ELISA法检测抗体水平;采用淋巴细胞增殖试验（MTT法）和流式细胞术（FACS）检测细胞免疫情况;采用PCR方法检测重组质粒在小鼠体内的生物安全性。结果显示,成功构建pcDNA—VP60真核表达质粒,并在RK13细胞中获得表达。重组质粒作为核酸疫苗能够诱导小鼠体内产生特异性抗体而且抗体水平随免疫次数增加而逐渐增高,在免疫后49d时达到峰值;脾淋巴细胞刺激指数和CD4＋、CD8＋淋巴细胞亚群数量百分率明显增高,且与对照组存在明显差异。经PCR鉴定VP60基因未整合到小鼠主要脏器染色体上。结果表明,构建的pcDNA—VP60真核表达质粒能够诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,重组质粒对小鼠是安全的。     

稳定表达兔岩藻糖基转移酶RK13细胞系的建立

为了构建稳定表达兔岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase,FUT2)的RK13细胞系,本研究将FUT2基因编码序列插入到慢病毒载体p LOV-GFP-3Flag中,构建了p LOV-3Flag-FUT2重组质粒。将p LOV-3Flag-FUT2与包装质粒ps PAX2和外膜质粒p MD2.G共转染293T细胞,获得重组病毒样颗粒。用含病毒样颗粒的细胞培养上清液感染RK13细胞,并通过嘌呤霉素筛选、纯化,获得稳定表达FUT2的细胞系,命名为RK-FUT2细胞。连续培养10代后,利用PCR、RT-PCR和Western blot方法鉴定,结果表明,RK-FUT2细胞系能够稳定表达兔岩藻糖基转移酶。该细胞系为研究FUT2在兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)感染过程和致病机制中的作用提供了有力工具。     

鸡β-防御素Gal-1 cDNA的克隆及序列分析

利用细胞总RNA提取试剂盒,从1月龄SPF鸡白细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-1)cDNA片段。PCR产物经凝胶回收纯化后与pMD18-T载体连接,转化感受态JM109细胞,在含X-gal、IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与质粒限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段ORF大小为198bp,用Blast程序进行检索比较表明该序列与Genbank中发表的鸡Gal-1 cDNA编码区序列同源性高达99.5%。该cDNA序列编码65个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由40个氨基酸残基组成。     

兔出血症病毒缺失突变体的构建及鉴定

为研究兔病毒性出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）衣壳蛋白与病毒侵染性的关系,在RHDV侵染性克隆的基础上,构建了缺失衣壳蛋白（VP60）部分编码基因（5 325-6931 nt）的全长cDNA分子克隆。然后,在体外转录合成RNA,转染RK-13细胞,观察RHDV缺失5 325-6 931 nt区域以后,病毒的侵染性以及病毒复制能力的变化情况。结果表明,5 325-6 931 nt区域缺失以后,病毒的侵染性没有明显改变,但是病毒的复制能力有所下降。可见,该区域含有与病毒复制有关的调控序列或元件。     

禽网状内皮组织增生症病毒p30蛋白的表达及检测

根据禽网状内皮组织增生症病毒SNV株的前病毒基因组cDNA序列设计并合成1对引物,以pPB101质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒p30基因片段。将PCR产物克隆入表达载体pCold-HF中,构建的原核表达质粒pCold-p30转化BL21（DE3）菌,经IPTG诱导,p30蛋白呈现可溶性表达。用表达产物免疫6周龄BALB/c小鼠,制备p30抗体,经Westernblot和间接免疫荧光法检测,结果发现,原核表达的SNV株p30蛋白具有良好的免疫原性。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株HLJ-0504 VP5基因缺失株感染性克隆的构建及鉴定

利用体外定点突变技术,缺失vvIBDV HLJ-0504株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列（HamRz）和丁肝病毒核酶序列（HdvRz）。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGGs的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGHLJ0504A△VP5HRT,将该感染性克隆与pCAG—GHLJ0504BHRT共转染DF—Ⅰ细胞。IFA,RT—PCR,电镜观察均显示获得重组病毒,将其命名为rHLJ0504HT△VP5。vvIBDVVP5基因缺失感染性克隆的成功构建为我们利用反向遗传操作技术快速致弱vvIBDV,构建IBD的候选疫苗株奠定了基础。     

Pseudorabies virus propagated in rabbit kidney-derived RK13 cells is neutralized by natural IgM antibodies in normal swine serum which specifically lyse host cells

Pseudorabies virus (PRV) propagated in rabbit kidney-derived RK-13 cells (PRV-RK) was neutralized by serum obtained from specific pathogen-free pigs through the activation of complement. The virus-neutralizing activity of swine serum was lost after treatment with ethylene glycol-bis-aminoethylether-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Anti-C1q and anti-IgM antibodies also inhibited virus-neutralizing activity. Though IgG-depleted swine serum neutralized PRV, IgM and IgG-free swine serum lost virus-neutralizing activity. Pre-incubation of swine serum with RK-13 cells, but not with swine kidney-derived CPK cells, at 4 degrees C eliminated the virus-neutralizing activity to PRV-RK. Results indicated that swine serum contained natural IgM against an antigen(s) on the RK-13 cell surface and that this surface antigen was integrated into the PRV envelope during the budding process. Thus the natural IgM in swine serum reacted with the RK-13 antigen on the viral envelope, activated the complement cascade and neutralized the PRV-RK.     

禽流感病毒新疆分离株1/96(H14N5)非结构蛋白基因克隆及序列分析

研究应用无特定病原体 (SPF)鸡胚增殖禽流感病毒分离株 A/ Chicken/ Xinjiang/ 1 / 96(H1 4 N5) ,提取病毒基因组及病毒感染鸡胚绒毛尿囊膜细胞信使 RNA,运用 RT-PCR技术扩增病毒分离株的 NS1和 NS2基因 c DNA,克隆后进行序列测定。序列测定后分析结果表明 ,扩增的两个基因包含完整的阅读框架     

编码日本血吸虫Akt蛋白的cDNA克隆及原核表达

本研究利用生物信息学分析日本血吸虫编码Akt蛋白的cDNA并对编码该蛋白的cDNA进行了克隆和原核表达。生物信息学分析表明日本血吸虫存在两个Akt蛋白。利用PCR将其中一个Akt蛋白催化功能域的编码cDNA进行了克隆,并利用原核表达系统对此蛋白片段进行诱导表达并进行了重组蛋白的纯化,将重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。Western blot分析表明,该抗体能被日本血吸虫Akt重组蛋白特异性识别。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

黑斑侧褶蛙5类抗菌肽基因的克隆及其成熟肽理化性质的预测

抗菌肽是蛙类非特异性免疫的重要组成部分,蛙类对环境变化比较敏感,但仍能分布于广泛的地理区域,抗菌肽的多样性和组成是揭示其适应机制的基础。本研究通过RT-PCR技术,从1只黑斑侧褶蛙的皮肤组织中克隆了9条不同的cDNA序列,分属5个家族:Esculentin-1、Esculentin-2、Temporin、Nigrocin-1和Nigrocin-2。其中Esculentin-1、Esculentin-2、Temporin和Nigrocin-1为阳离子抗菌肽,等电点(PI)8.72～9.63,分子量(Mw)1495.87～4862.9,预测的二级结构都具有α-螺旋结构。Nigrocin-2为新发现的一类酸性抗菌肽,等电点PI为4.0,Mw为1798.06,带1个负电荷,预测二级结构不具有α-螺旋结构,呈无规则卷曲。这9条抗菌肽cDNA来自50个阳性克隆,显示出黑斑侧褶蛙抗菌肽具多样性,特殊抗菌肽的发现也预示着黑斑侧褶蛙适应复杂多变环境、分布广泛的生理潜能,但具体功能还需进一步研究。     

新城疫病毒LaSotaC5株感染性克隆的构建及病毒拯救

将本实验室保存的一株LaSota病毒用有限稀释法接种鸡胚进行纯化,连续传代5次后筛选到1株高血凝效价的纯培养克隆株,命名为LaSotaC5,并对其进行全基因组测序,克隆株与亲本株在生物学特性与基因序列上都存在一定的差异。参照LaSotaC5株全基因序列单酶切位点,用RT-PCR的方法将基因组分8段扩增,按照病毒基因组的结构顺序,将克隆片段定向插入到TVT转录载体中,成功构建含有病毒全长eDNA的转录载体TVT．LaSotaC5。将TVT-LaSotaC5与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI—L共转染BSR—T7／5细胞,成功拯救出了具有感染性的LaSota株新城疫病毒。病毒的成功拯救为后续基因功能和疫苗载体开发等方面的研究提供了平台。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原优势区域的鉴定

流行性乙型脑炎（Japanese Encephalitis,JE）是一种人与动物共患的虫媒病毒性疾病,严重危害着人畜的健康。E蛋白是乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。为了确定该蛋白的抗原优势区域,本研究设计了3对引物,将E蛋白分成3个大段,分别是EF1（1～291aa）、EF2（292～402aa）和EF3（403-500aa）,又将EF1分成4个相互重叠的小片段,分别是EF1-1（1～88aa）、EF1—2（68～155aa）、EF1—3（129～222aa）和EF1—4（202～291aa）,将以上基因片段分别克隆到原核表达载体进行GST融合表达。SDS-PAGE电泳鉴定各融合蛋白均获得表达,各表达产物以包涵体的形式存在。通过Western blot分析表明融合蛋白GST-EF1、GST—EF2、GST—EF1—1、GST-EF1-2、GST—EF1—3和GST—EF1～4均能被阳性血清识别。通过ELISA鉴定,GST-EF2反应性最强,GST-EF1反应性比GST-EF2稍弱,而GST-EF3反应性最弱,GST-EF1-1、GST-EF1—2、GST-EF1—3和GST—EF1—4片段融合蛋白反应性与GST—EF1相似。由此本研究鉴定出1-402aa是E蛋白的抗原优势区域,在此区域内包括了12个Cys的保守区及域Ⅰ、域Ⅱ和域Ⅲ3个主要抗原域。E蛋白抗原优势区域的鉴定,为E蛋白抗原表位的鉴定以及针对于E蛋白诊断试剂的开发奠定了基础。     

转hTERT基因的山羊胎儿成纤维细胞的生物学特性及其表达分析

用脂质体介导法将hTERT基因转染到山羊胎儿成纤维细胞中,以期获得永生化的山羊胎儿成纤维细胞系。对转染后的阳性细胞进行细胞学和分子学相关检测。结果显示,导入hTERT的阳性细胞形态正常,并已传至第58代;未转染组细胞经长期传代后（30代）,增殖缓慢,部分细胞表现衰老和凋亡的迹象。RT-PCR检测转染组细胞中有hTERT基因表达。生长曲线绘制结果显示转染组（30代和50代）山羊胎儿成纤维细胞生长速度稍快于未转染组（5代）细胞,但差异不显著（P〉0.05）。转染组细胞生长旺盛,细胞接种后第6天,基本覆盖培养孔。而未转染组（30代）细胞一直生长缓慢,差异显著（P〈0.05）。未转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞处于S期细胞和G1期细胞分别为28.9%和60.8%,而转染组（30代）分别为45.2%和45.0%。说明外源性hTERT基因可促进山羊胎儿成纤维细胞由G1期向S期转变,并提高细胞增殖能力。转染组（50代）山羊胎儿成纤维细胞染色体核型正常,未发生变化。未转染组（30代）细胞凋亡率和死亡率分别为39.7%和29.4%,而转染组（30代）分别为11.0%和12.7%,差异极显著（P〈0.01）。hTERT蛋白在转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞中表达,蛋白相对分子质量为127 000。说明外源性hTERT基因可以延长胎儿成纤维细胞在体外培养的寿命,降低细胞凋亡率。