奶牛α-干扰素克隆表达和生物学活性分析

提取经植物血凝素诱导培养的我国健康奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛α-干扰素(BoIFN-α)成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为牛α-干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达,表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在。用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性。重组奶牛α-干扰素对VSV的抗病毒活性为4.26×105U/mL,对IBRV的抗病毒活性为8.91×104U/mL。结果表明,重组奶牛α-干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定。     

梅花鹿γ干扰素克隆表达及抗病毒活性测定

提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为梅花鹿γ干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%.将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠埃希菌BL21中实现了高效表达.表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的32.6%.用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性,重组梅花鹿γ干扰素抗病毒活性分别约为7.25×104 U/mL和4.61×104 U/mL.结果表明,重组梅花鹿γ干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定.     

猪β-干扰素的基因改造表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9 mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28 ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×10³ IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×10³ IU/mL。     

具抗病毒活性的重组牛IFN-αA的冷激诱导表达与鉴定

为了在E.coli表达系统中高效表达具有抗病毒活性的重组牛α干扰素蛋白(rBoIFN-α),本研究通过PCR扩增牛α干扰素A亚型(BoIFN-αA)基因,并在其上游连接内含肽(SDI)序列,克隆于pColdⅢ中构建内含肽-冷激表达重组质粒pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α,16℃低温诱导表达。结果表明,rBoIFN-α实现了高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,经Ni柱纯化后得到浓度为0.12 mg/mL的目的蛋白。经MDBK-BVDV干扰素活性检测系统检测显示,表达的rBoIFN-α抗病毒活性为9.86×105U/mg。本研究结果为具有抗病毒活性的rBoIFN-α后续应用研究奠定了基础。     

梅花鹿IFN-β1的原核表达及活性鉴定

为表达具有抗病毒活性的梅花鹿干扰素β1(IFN-β1),本研究通过PCR扩增梅花鹿IFN-β1基因,将其克隆至原核表达载体p ET-28a中,构建重组质粒p ET-IFNβ1,并将其转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后,得到高效表达。SDS-PAGE与western blot分析结果表明,梅花鹿IFN-β1重组蛋白的分子量大小约为24 ku,表达产物主要为不溶性的包涵体,表达量占菌体总蛋白的59.02%。将Ni柱纯化的p ET-IFNβ1诱导表达产物复性后,细胞病变抑制法检测表明表达产物具有抗病毒活性,其抗病毒活性可以达到10×53.81U/0.1 m L。梅花鹿INF-β1的表达为梅花鹿INF-β1的应用奠定了基础。     

猪α干扰素基因突变、表达及其高效抗病毒活性筛选研究

利用RT-PCR方法从猪肝细胞总RNA中扩增出编码猪α干扰素基因,根据大肠杆菌偏嗜性及活性位点改造基因并克隆至原核表达载体p ET21a,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定。重组蛋白以包涵体形式表达,经变-复性及纯化处理后,获得多种不同基因型的高纯度猪α干扰素。用细胞病变抑制法在MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定,结果表明经过基因改造的猪α干扰素(Po IFN-M6)具有更高抗病毒活性,约为2.97×108U/mg。本研究为猪α干扰素基因工程产品的研发及其在临床兽医的应用奠定基础。     

猪α-干扰素基因在大肠杆菌中的表达及活性测定

根据GenBank中登录号为M28623的基因序列,合成猪α-干扰素成熟肽基因,并将该基因克隆至pQE-31载体,转化宿主菌M15诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明该蛋白以包涵体形式表达,分子量约21 ku,经包涵体变性复性后获得了具有抗病毒活性的干扰素,用MDBK-VSV系统检测其抗病毒活性不低于1010 U/0.1 mL.     

吉林白鹅α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。     

牛β-干扰素在新城疫病毒La Sota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

研究利用新城疫病毒La Sota株作为表达载体,构建表达牛β-干扰素基因的重组新城疫病毒全基因组质粒pFL-BoIFN-β, 与辅助质粒共转染BHK-21细胞后获得表达BoIFN-β的重组新城疫病毒.收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒经RT-PCR检验证实重组病毒含有相应外源基因.将重组病毒尿囊液经紫外线照射以灭活新城疫病毒,利用表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒在牛肾细胞上测定rL-BoIFNβ抗病毒活性, 表达BoIFN-β的重组新城疫病毒能有效抑制重组水泡性口炎病毒在牛肾细胞上的复制, rL-BoIFNβ接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2×107 IU/mL.结果表明:重组新城疫病毒rL-BoIFNβ接种的SPF鸡胚尿囊液具有高效而稳定的抗病毒活性,重组新城疫病毒可以作为外源蛋白的高效表达载体而广泛应用.     

惠阳胡须鸡IFN-α、IFN-β基因在大肠杆菌中的表达及其抗病毒活性比较

构建了惠阳胡须鸡IFN-α/pGEX-6P-1I、FN-β/pGEX-6P-1的重组质粒,并在BL21中表达,对重组蛋白进行了抗病毒活性测定,结果表明IFN-αI、FN-β重组蛋白的抗病毒活性分别为7.9×105U/mg和6.4×104U/mg,IFN-α的抗病毒活性是IFN-β的12倍。IFN-αI、FN-β与干扰素受体具有不同的结合位点和结合途径可能是使IFN-α和IFN-β的生物学活性存在较大差异的原因。     

H5N1亚型禽流感病毒和新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞IFN-β基因的动态表达

根据鸡β-干扰素（ChIFN-β）基因保守序列设计引物建立了检测鸡IFN-β mRNA表达水平的荧光定量RT-PCR (RRT-PCR)方法,并对H5N1亚型禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒强毒株（vNDV）感染后3、6、12、24、30 h的鸡胚成纤维细胞（CEF）中IFN-β mRNA表达水平进行了检测。结果显示,建立的RRT-PCR特异性好,对鸡IFN-β mRNA的扩增效率为94.18%,线性范围为10^-8～10^-3,相关系数为0.992,最低能检出48拷贝/反应。AIV在感染CEF后6、12 h显著抑制IFN-β mRNA的表达,24 h开始诱导IFN-β mRNA表达,30 h时IFN-β mRNA水平显著升高;vNDV在感染CEF后的24 h内显著抑制IFN-β mRNA的表达,30 h时则显著诱导 IFN-β mRNA表达。本试验结果为进一步研究H5N1和NDV与机体的相互作用提供了有价值的信息。      

牛干扰素-γ基因的克隆、序列分析及表达研究

为了使干扰素-γ(interferon γ,IFN-γ)在牛结核等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,试验采用RT-PCR法从云南本地黄牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增牛IFN-γ(BoIFN-γ)基因,测序并进行序列分析;然后亚克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。序列分析结果表明,克隆的IFN-γ基因与GenBank中荷斯坦牛IFN-γ序列同源性达99.60%。表达产物经SDS-PAGE分析,在大小约23 ku处可见目的蛋白表达条带,与预期结果一致;用ELISA检测,表达的蛋白具有明显的生物学活性,在菌体中的含量为244 ng/mL。本试验结果为牛IFN-γ蛋白的进一步研究和应用奠定了基础。     

蜜蜂球囊菌全长cDNA文库的构建与分析

本试验利用TRIzol试剂盒提取蜜蜂球囊菌总RNA,通过Oligotex纯化试剂盒将mRNA反转录成cDNA,再以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA,该cDNA产物经分级分离和体外包装,即获得蜜蜂球囊菌cDNA原始文库,其滴度测定为1.6×106PFU/mL,扩增后的滴度是1.5×109PFU/mL;取适量扩增文库稀释并铺平板,蓝白斑筛选独立噬菌斑,用M13±通用引物进行PCR扩增后,文库的重组率达到90%,插入cDNA片段的长度在0.5~2 kb。该文库的构建,有利于筛选目的基因,便于深入研究蜜蜂白垩病的侵染机制,最终有效防制白垩病。     

高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1株Nsp2基因分段克隆表达及其单克隆抗体的制备

分析猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）非结构蛋白Nsp2,扩增和克隆JXA1株Nsp2基因的4个片段,并将它们分别插入pGEX-6P-1表达载体构建重组表达质粒,经IPTG 诱导表达得到蛋白,纯化后进行活性鉴定。以分段表达的蛋白为抗原,建立间接ELISA方法用于杂交瘤细胞株的筛选。用PRRSV NVDC-JXA1株灭活疫苗对BALB/c小鼠进行常规免疫,最后一次用活毒加强免疫,取其脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇作用下融合,经过选择性培养、有限稀释筛选到1株针对Nsp2的杂交瘤细胞株6B8。鉴定结果表明,该株杂交瘤细胞仅与4个蛋白片段中的Nsp2F1有反应,细胞经长期体外培养和冻存后复苏能稳定分泌抗体,上清效价达1∶210,腹水效价达1∶106。本研究成功表达了4个PRRSV JXA1株的非结构蛋白Nsp2的片段,以其为抗原建立筛选方法,得到1株针对Nsp2的单克隆抗体,为研究Nsp2功能和建立相关诊断方法奠定物质基础。     

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamH I和Xho I位点粘性末端的双链DNA。真核表达载体pcDNA3.1（+）经BamH I 和Xho I限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序。测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1（+）真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础。     

银狐生长激素cDNA克隆和原核表达

为了获得重组的银狐生长激素,本试验用Trizol的方法从银狐脑垂体组织中提取总RNA,以mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出生长激素成熟cDNA片段并克隆到载体质粒pMD18-T中;通过含有BamHⅠ酶切位点的特异引物从pMD18-T-fGH中亚克隆出cDNA片段,并将其重组到pPROEX^TMHta质粒中,构建了银狐生长激素原核表达质粒pPROEX^TMHta-fGH。将pPROEX^TMHta-fGH原核表达质粒转化DH5α大肠杆菌,用终浓度1 mmol/L IPTG进行诱导,通过SDS PAGE进行检测。结果表明在转化的大肠杆菌中检测到分子量为26 kD的fGH蛋白的存在,表达量占菌体蛋白总量的35%,并且表达产物以包涵体的形式存在。     

小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析

试验利用PCR技术从自行分离的GPV基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段,并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,提取重组质粒经PCR和酶切鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明,VP3基因全长1605 bp,编码534个氨基酸;分子生物学分析表明所分离到的病毒为强毒株。     

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础。将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95- (C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定。同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测。结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性。同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性。EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌诱发建立乳房炎小鼠病理模型

为了建立小鼠乳房炎模型,将30只昆明小鼠随机分成3组,分别经第4对乳腺注入50μL的生理盐水、1.0×105CFU/mL和2.0×105CFU/mL的金黄色葡萄球菌,观察乳腺组织的外形和组织切片的变化;结果表明,注菌后24 h,小鼠出现明显的临床症状,乳腺出现不同程度的炎性症状,组织病理学显示腺泡腔内有大量嗜中性粒细胞浸润,泡腔间隔增宽。说明金黄色葡萄球菌能够诱发试验性乳房炎。     

猪圆环病毒2型ORF2重组腺病毒的构建与鉴定及其免疫效果研究

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,本试验根据GenBank中猪圆环病毒2型基因序列,设计了1对引物,用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增。将目的基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ORF2。经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明该基因已成功连接后,重组腺病毒转移载体经PmeⅠ酶切线性化,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-CMV-ORF2。经PCR方法和PacⅠ酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已构建成功。PacⅠ酶切线性化pAd-CMV-ORF2,脂质体法转染AD293细胞进行病毒的包装和扩增。PCR及RT-PCR、IFA、Western blotting检测目的基因及其表达。结果表明,本试验成功构建了重组腺病毒pAd-CMV-ORF2。3次噬斑试验纯化重组腺病毒,测得其TCID50为10-8.75/0.1 mL。将重组腺病毒接种SPF级雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗体检测试剂盒检测特异性抗体水平。小鼠免疫试验测得其特异性抗体水平较高,为PCV2重组腺病毒基因工程疫苗的进一步研究打下基础。