马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株致弱过程中不同代次病毒LTR的进化分析

为揭示马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗的减毒机理,本研究对EIAV弱毒疫苗株在体外驴白细胞传代过程中不同代次毒株的长末端重复序列(LTR)进行扩增和分析。结果显示:随着病毒在体外传代次数的增加,各病毒株遗传多样性逐渐增加,并与致弱前亲本株EIAVDV117的遗传距离逐渐增大;EIAV在体外传代过程中LTR的变异主要集中在U3区和R区的转录起始位点,但随着传代次数的增加,在负调节区丢失了GATA结合位点,并在增强子区出现了E-box基序。此外,传代初期低代次病毒株与后期的高代次弱毒株在负调节区的AP-1结合位点和转录起始位点以及TAR的起始位点存在明显差异。     

马传染性贫血病毒弱毒株LTR点突变型嵌合感染性克隆的构建

马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）长末端重复序列（Long terminal repeat,LTR）是基因组中高度变异区之一,EIAV LTR的变异对于指导病毒的复制和病毒致病性具有重要的生物学意义。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,由马传贫强毒至弱毒致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,以驴胎皮肤弱毒株疫苗全长感染性克隆pLGFD3-8为父本,选取LTR R区的TAR起始碱基,poly（A）附加位点,采用反向遗传操作对其位点进行PCR体外定点突变,将弱毒序列构建的逆向点突变型全基因克隆转染到驴胎皮肤细胞（FDD）并在FDD上传代,通过逆转录酶活性（RT）检测、RT-PCR方法及real-time RT PCR检测并验证其感染性。检测结果为构建的逆向点突变型感染性克隆在FDD上被拯救,其衍生病毒感染的FDD上出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性;电镜下可见大量典型的EIAV颗粒pLGFD-M点突变型嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8复制水平相似。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。     

鹅细小病毒弱毒株的培育及其致弱前后全基因组中核酸变异的分析

为制备鹅细小病毒(GPV)弱毒株并研究其传代致弱前后的基因变化情况,本研究将GPV YG株在鹅胚成纤维细胞(GEF)和鸭胚成纤维细胞(DEF)中交替传代培养至72代次,并且对F0、F24、F48和F72代次病毒进行PCR全基因组扩增和测序。序列比对结果显示,F72代与F0代相比,5'和3'非编码区存在163个核苷酸差异,多数集中于反向终端重复序列(ITR)中,5'和3'两端均有6段碱基插入;编码区氨基酸序列比对结果显示,与F0代次病毒相比,F72代次病毒共有23个氨基酸位点突变,18个位于VP蛋白,5个位于非结构蛋白。病毒致病性试验表明,随着传代次数的增加,其毒力呈减弱趋势,并且F72代次病毒进一步致弱。本研究对GPV致弱后基因变化情况的分析及动物致病性试验结果为GPV毒力致弱机制的研究奠定了基础。     

马传染性贫血病毒第19、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA全基因序列分析

不同代次马传染性贫血驴胎皮肤细胞弱毒(Fetal donkey dermal virus,FDDV)的免疫保护效果各不相同,只有第10～15代驴胎皮肤细胞弱毒具有良好的免疫保护效果,可作为疫苗使用,继续传代则疫苗的保护率下降。为确定有、无免疫保护效果的FDDV在基因水平上的差异,本实验对无免疫保护效果的第19、26代驴胎皮肤细胞弱毒前病毒DNA进行了全基因序列测定,并与已测序的疫苗毒株进行序列比较。第19代和第26代FDDV全基因核苷酸序列同源性高达99.5%,与疫苗毒株全基因核苷酸序列的同源性分别为96.9%、96.7%。LTR是EIAV在细胞传代中变异最显著的区域,第19、26代FDDV的LTR与疫苗毒的LTR同源性仅为89.6%、89.3%。马传贫病毒的gag基因高度保守,第19、26代FDDV与疫苗毒株的gag基因推导氨基酸序列仅有2个氨基酸不同。第19、26代FDDV与疫苗毒株的pol基因、env基因的推导氨基酸序列的同源性分别为98.9%、98.8%、93.7%、93.6%。由序列比较结果可以推断,第19代、第26代FDDV不具有免疫保护效果的主要原因可能是由于LTR和env基因的变异,导致病毒复制能力下降或免疫原性丧失,不能诱导机体产生良好的免疫反应。     

Tat蛋白对马传染性贫血病毒长末端重复序列启动子活性的影响

将来源于马传染性贫血病毒（EIAV）强毒株第25代和第118代病毒的LTR，白细胞弱毒（EIAV-DLA）的LTR，以及TAR起始碱基和／或poly（A）附加位点发生突变的驴胎皮肤细胞弱毒（EIAV—FDD）的LTR分别克隆到pCAT3-Basic质粒中，获得了6个重组质粒pCAT-25、pCAT-118、pCAT—FD、pCAT—G219A、pCAT—A294C和pCAT—G219A—A294C。同时用pcDNA3．1（＋）构建了EIAV反式激活蛋白（Tat）基因的重组真核表达质粒pcTM7-D。将pcTM7-D分别与含有不同LTR的重组质粒共转染驴胎皮肤细胞，考察Tat对LTR启动子活性的增强作用。结果表明，在皮肤细胞中Tat蛋白可以特异性增强来源于皮肤细胞弱毒疫苗株LTR的启动子活性，而对白细胞源的LTR无明显增强作用；TAR起始位点和poly（A）的单碱基突变和联合突变对Tat的反式激活作用并无明显影响。     

马传染性贫血病毒LTR在驴胎皮肤细胞中的基因进化及启动子活性比较

将EIAV驴白细胞弱毒疫苗株在驴胎皮肤细胞中连续传代,分别提取第13代、18代、21代、23代、26代病毒培养物的前病毒DNA,以LTR特异性引物PCR扩增前病毒LTR,并进行克隆及测序分析。与本实验室已测定的驴白细胞毒株LTR的序列比较发现,驴胎皮肤细胞毒株LTR的U3负调节区出现大段的插入、点突变、缺失,U3增强子区变异较小。将LTR片段插入到pCAT-basic载体CAT报告基因前,转染驴胎皮肤细胞,通过检测CAT表达量来评价LTR的启动子活性。驴胎皮肤细胞毒株LTR的启动子活性随着病毒传代次数的增加而逐渐增强,而驴白细胞弱毒株LTR的启动子活性很低。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP5基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)Gx株进行培育,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱,对其非结构蛋白VP5基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析,从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律.对不同代次细胞毒序列分析的结果表明,细胞毒在第8代以前,VP5基因序列没有改变,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达98%以上;细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变;10代毒VP5基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达99%;细胞适应毒传至20代,其VP5基因序列不再改变.从而说明,vvIBDV Gx株VP5基因在致弱过程中存在变化规律.     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP3基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDV Gx株进行培育，通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱，对其结构蛋白VP3基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析，从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律。对不同代次细胞毒序列分析的结果表明，细胞毒在第8代以前，VP3基因序列没有改变，与标准超强毒HK46株氨基酸同源性达99％以上；细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变；10代毒VP3基因与标准弱毒P2株氨基酸序列同源性达100％；细胞适应毒传至20代，其VP3基因序列不再改变。从而说明，vvIBDV Gx株在致弱过程中，VP3基因也随之改变。     

9株猪瘟分离毒株的致病特性

采用9株临床表现强、中、低致病特点的猪瘟野毒分离株第3代细胞毒作为种毒,按3mL/头剂量分别注射猪瘟抗原及抗体阴性猪,再用上一代传代猪发病后的血毒作为下一代接毒用种毒接种试验猪1头或2头,或上一代传代猪发病后,同圈放入1头或2头试验猪进行同居感染.如此进行,GDGZ1/95、BJCY1/96和JL1/94传至8代;FJFQ1/99传至7代;HeBHH1/95、HeNBY1/96、BJTX3/96、GXBH1/98和HeNXH2/98传至3代.结果显示:上述分离株传至3～5代过程中均表现出毒力增强的趋势,从3～5代传代到8(7)代的过程中毒力进一步增强并保持稳定,且均超过了标准石门强毒株的发病特点.所有试验猪均出现较典型的猪瘟临床症状,解剖后均表现出不同程度的病理变化,死后或解剖后的各种脏器经HCFA检查均为强阳性,这种现象进一步证实了猪是猪瘟病毒的敏感动物,各毒株之间毒力没有明显差异.对其中7株分离株传代血毒部分代次E2基因主要区域进行序列分析,结果仅GDGZ1/95株从F1～F8代中的F6代有2个核苷酸的差异,引起1个相应氨基酸的变异,其余毒株的不同代次没有碱基发生变异,初步说明猪瘟病毒基因型表现相对的稳定性.     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性评价

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因重组鸡痘病毒（rFPV-ILTVgB)的稳定性，我们对重组病毒进行6代和16代克隆纯化，对纯化后的病毒通过转瓶连续培养传20代，结果发现第6代纯化病毒（rFPV-ILTVgB-C6)在传代过程中有白斑出现，说明病毒纯度不够；经过16代纯化的病毒（rFPV-ILTVgB-C16)对细胞的嗜性加强，病毒的效价进一步升高，20代传代后蓝斑率仍然为100％，PCR的检测进一步证明插入的外源基因能在病毒的长期传代过程中稳定地遗传。抽取病毒细胞传代过程中的第5，10，15，20代次的病毒翅膀内侧无血管处皮下接种2周龄SPF鸡，20天后分为两组，分别用传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒102株攻击，结果不同代次的重组病毒均可以使免疫鸡抵抗传染性喉气管炎病毒和鸡痘病毒强毒的攻击，鸡体内病毒传代试验表明，重组病毒在接种部位仅存在6天，之后就检测不到病毒，重组病毒通过SPF鸡连续传代，不存在病毒返祖的可能，由此可以得出一个结论：rFPV-ILTVgB在结构上和免疫原性上是稳定的，无论是在体外传代，还是在体内均可以稳定遗传，不存在因为接种重组疫苗而给免疫鸡群带来安全威胁的可能，完全可以作为疫苗毒株进行商品化开发。     

带有组氨酸标签的马传染性贫血病毒感染性分子克隆的构建

马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题.本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入NspV位点,获得带有组氨酸标签的重组质粒pOK8266-HIS.将pOK8266-HIS转染驴白细胞,将驴白细胞转染产物传至第6代时,在电镜下观察到了典型的马传染性贫血病毒粒子.提取pOK8266-HIS衍生病毒的前病毒基因组DNA,通过PCR扩增和测序表明,衍生病毒基因组中引入了6个组氨酸标签,从而获得了带有分子标志的马传染性贫血弱毒疫苗株,为野毒株和疫苗病毒的鉴别诊断奠定了基础.本研究还证明了S2基因中的插入突变并不影响马传染性贫血病毒的体外复制.     

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒株LTR启动子功能的研究

为了证明我国马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）驴白细胞弱毒株的长末端重复序列（ＬＴＲ）是否能够启动基因的表达,我们将该ＬＴＲ克隆于含ＣＡＴ基因的载体中,获得重组质粒ｐＣＡＴ－ＬＴＲ,用ｐＣＡＴ－ＬＴＲ分别转染驴胎皮肤细胞（ＦＤＤ）、胶质母细胞瘤（ＴＪ－９０５）细胞、驴白细胞及接种ＥＩＡＶ弱毒的ＦＤＤ及驴白细胞,结果以ＥＩＡＶ弱毒的ＬＴＲ为启动子,ＣＡＴ在这几种细胞中均获得了不同程度的表达,证实了我国ＥＩＡＶ弱毒株的ＬＴＲ在ＦＤＤ、ＴＪ－９０５及驴白细胞中确实具有一定的启动子功能,并能被反式激活表达,为进一步研究ＥＩＡＶ弱毒复制及表达调控奠定了基础。     

Virulence and in vitro growth of a cell-adapted strain of equine infectious anemia virus after serial passage in ponies

Five serial passages of a cell-adapted strain of equine infectious anemia (EIA) virus were conducted in Shetland ponies. The 13 recipient ponies became agar-gel immunodiffusion test-positive by 25 days after they were inoculated. The virulence of the cell-adapted strain of EIA virus markedly increased through 3 serial passages, although individual variation within passages was high. The 1st serial-passage recipient remained afebrile through 200 days, whereas a febrile episode occurred about every 185, 44, 35, and 33 days in the 2nd, 3rd, 4th, and 5th serial-passage recipients, respectively. Severe clinical signs of EIA were noted in the ponies at each serial passage, but the mean virulence rating of each passage, graded on frequency of febrile episodes and number of clinical signs evident within 200 days after ponies were inoculated, increased from 0 through 4, 21, 24, and 29 for the 1st through 5th serial passages, respectively. Isolates of EIA virus, made in fetal equine kidney cells, were obtained from plasma of 75% of the samples of blood collected during febrile episodes and from 45% of the samples collected during afebrile periods, indicating that the cell culture growth capacity of this strain of EIA virus may be relatively stable through 5 serial passages in Shetland ponies.     

African swine fever virus: generation of subpopulations with altered immunogenicity and virulence following passage in cell cultures.

Virus subpopulations with variable virulence, immunogenicity, and infectivity to pigs were readily generated by passaging Tengani isolate of African swine fever virus, either biologically cloned or uncloned, in Vero cell cultures. Avirulent virus populations which account for more than 99% of virus in an uncloned preparation of the 27th passage are laboratory artefacts, perhaps do not exist in nature. Furthermore, attenuation of virulence did not occur uniformly in all subpopulations newly generated, and a continuous modulation of virus populations differing in immunogenicity and virulence took place in the same individuals inoculated with the 27th passage virus. The same virus preparation, appearing to be slightly virulent in pigs, contained at least a virulent subpopulation that was manifested only by further inoculating susceptible pigs with viremic blood collected at various times during the clinical course. A cloned virus after 23 passages in cell cultures generated a subpopulation (99.9%) which induced subclinical infection in pigs; however, the infection did not confer a solid immunity to homologous challenge with Tengani isolate in these pigs. The Tengani isolate contained subpopulations of virus with immunogenicities shared by the Lisbon '60 isolate and also contained at least one subpopulation specific for the Tengani only.     

表达鸡马立克氏病病毒gB基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性及生物安全性评价

为了评价表达鸡马立克氏病病毒gB基因重组鸡痘病毒(rFPV-gB/R)的遗传稳定性,我们将纯化后的重组病毒在CEF单层上连续传30代,引起细胞病变的速度和形态均未发生明显变化;覆盖含X-Gal的琼脂引起的空斑均为蓝色;间接免疫荧光实验证明rFPV-gB/R中的gB基因始终能稳定表达;序列测定结果表明,重组病毒在细胞上连续传30代、在SPF鸡上连续传5代后,gB基因序列没有发生任何变化;以0、10、20、30代重组病毒制成冻干疫苗进行的实验室免疫效力实验表明,细胞连续传代后rFPV-gB/R仍然保持了原有的免疫原性。可见重组鸡痘病毒gB基因的结构和免疫原性都是高度稳定的。为了评价rFPV-gB/R的生物安全性,我们将rFPV-gB/R通过SPF鸡连续传5代,检测病毒在鸡体的存在部位及其消长、生长繁殖性能和毒力变化;将rFPV-gB/R免疫鸡与未免疫鸡同笼饲养,攻击FPV-102E6强毒,以检测rFPV-gB/R感染鸡的接触传染性。结果显示,rFPV-gB/R在鸡体的存在时间大约为7d,在体内仅存在于接种部位;鸡体传代后痘病毒毒力有一定程度下降,gB基因核苷酸序列未发生任何变化;同居未免疫SPF鸡在痘病毒强毒攻击后全部发痘,可见重组病毒免疫鸡没有接触传染性,能在鸡体内稳定地传代,rFPV-gB/R具有高度的生物安全性。