南京地区犬细小病毒基因型鉴定

为调查南京地区犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)基因型分布情况,采集南京市某宠物医院2012—2019年犬细小病毒病患犬粪便43份作为检测病料,通过PCR扩增犬细小病毒VP2基因片段,并将扩增产物测序,分析CPV基因型。结果显示,43份病料皆扩增出目的片段,经测序后使用MegAlign软件与GenBank中犬细小病毒已知基因型对比分析,其中New-CPV-2a基因型为26株,占60.5%;New-CPV-2b基因型为9株,占20.9%;CPV-2c基因型为8株,占18.6%。研究结果表明,南京地区近年来犬细小病毒基因型发生了很大的变异,以New-CPV-2a为优势基因型,同时存在New-CPV-2b和CPV-2c基因型。本研究为南京地区预防和治疗犬细小病毒病提供理论依据。     

犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析

试验旨在了解河北与甘肃地区犬细小病毒流行情况,并通过原核表达系统获得犬细小病毒VP2蛋白,制备该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究犬细小病毒致病机理和治疗方法奠定基础。从10份疑似感染犬细小病毒犬的病料中提取病毒基因组DNA,并以其作为模板进行VP2基因的PCR扩增,将目的片段进行测序和分析后克隆至原核表达载体pET-30a中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE鉴定表达后切割目的蛋白条带免疫豚鼠制备多克隆抗体。序列分析结果显示成功克隆VP2基因,10株分离株中CPV-2a型占80%,CPV-2b型占20%。本试验检测的毒株与部分中国毒株形成了一个分支,与韩国、美国分离株呈现一定差异,与意大利分离株同源性较低。Western blotting分析证实了通过原核表达系统成功获得的大小为70 ku左右的重组蛋白具有反应原性和免疫原性。该试验初步表明河北与甘肃地区以CPV-2a型为主,原核表达的VP2蛋白具有良好的抗原性,本试验结果为犬细小病毒的防控提供科学依据。     

猪伪狂犬病病毒LN1301株分离鉴定及其gE和TK基因的变异分析

通过查明辽宁省猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)的传染来源及其病原变异情况,为建立有针对性的诊断与防制方法提供基础依据。采集辽宁某猪场疑似伪狂犬病病死仔猪的脑组织病料,应用非洲绿猴肾(Vero)细胞分离培养,通过电子显微镜观察、病毒中和试验、聚合酶链反应、病毒TCID50测定和动物试验对所分离的病毒进行鉴定。结果确认从辽宁省成功分离到1株猪伪狂犬病病毒野毒株,暂命名为PRVLN/1301株。应用猪伪狂犬病毒(PRV)标准株设计引物对分离到的病毒进行gE和TK基因PCR扩增、T-A克隆、测序,成功扩增克隆出猪伪狂犬病病毒辽宁株PRVLN1301的主要毒力基因gE和TK基因序列。通过系统进化树分析表明该毒株与国内外参考毒株的同源性均在97%以上,核苷酸序列分析结果显示所分离的PRVgE基因存在第995位点由C-A的突变、第999位点由T-G的突变,氨基酸序列比对结果显示存在1个氨基酸L-Q位点的变化,即由亮氨酸变为谷氨酰胺,TK基因没有变异和缺失。说明该毒株与其他地区毒株为同一来源,但存在部分位点的变异。     

貉源犬瘟热病毒血凝素基因的克隆及序列分析

为了对1例貉源犬瘟热(CD)进行病毒检测并分析其血凝素H基因变异情况,本研究从1只疑似犬瘟热病死的貉采病料进行研磨,利用RT-PCR方法扩增犬瘟热病毒H基因,对扩增出的H基因片段进行克隆测序,并对得到的H基因序列进行分析。结果表明,该貉感染犬瘟热病毒,得到的H基因核苷酸和氨基酸序列与CDV野毒株同源性较高,分别为89.1%~98.0%和85.4%~97.5%。遗传进化分析表明其属于Asia-1型野毒株,N连接糖基化位点分析结果表明,该毒株在542aa处比参考野毒株多了1个潜在的N糖基化位点,在525aa-550aa间多出了1个抗原表位。     

不同遗传背景猪群体黏病毒耐药蛋白1基因多态性分析

为探讨不同遗传背景猪黏病毒耐药蛋白1（myxovirus resistance,Mx1）基因的遗传多态性,本试验采用RT-PCR方法扩增克隆出猪Mx1基因并进行生物信息学分析,采用高分辨率熔解曲线法（HRM）对民猪、长白山野猪与民猪杂交猪（简称野杂猪）和大白猪3个群体Mx1基因外显子2区多态性进行分析。结果显示,从民猪及野杂猪中成功克隆出4条Mx1基因mRNA序列。该序列含有1个1 992 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码663个氨基酸。比较发现4条Mx1基因序列中共含有30个SNPs位点,其中17个SNPs位点引起了氨基酸序列的变异。功能结构域分析发现,大部分氨基酸突变位点位于Mx1基因功能结构域两侧。HRM多态性分析显示,Mx1基因外显子2区DD基因型作为优势基因型在3个群体中具有最高的基因型频率,其中大白猪中DD基因型频率为100%,野杂猪为62.5%,民猪为56.2%。基因多态性分析还发现该区域存在更多的核苷酸及氨基酸突变位点,表明民猪和野杂猪Mx1基因存在更丰富的基因多态性。     

2008年-2009年广东番鸭细小病毒分子流行病学研究

VP2基因是番鸭细小病毒(MDPV)的主要免疫原性基因,其编码的VP2蛋白能够诱导机体产生中和抗体。本文对2008年～2009年从广东各县市分离、鉴定的11个MDPV野毒株VP2基因进行克隆测序,并对获得的VP2基因序列进行比较和分析。结果表明:11个不同分离株之间核苷酸序列同源性为98.7%-100%;与6个国内外参考毒株同源性为97.7%-99.6%;所有毒株都含有4个完全相同的潜在糖基化位点;说明该病毒保守度高,仅有个别的点突变。将分离株SL2连续传70代获得致弱毒株SL-70,动物实验结果表明SL70株对雏鸭无致病力;经测序发现SL-70与其祖代分离株SL2的VP2基因序列同源性高达99.9%,仅发生了18个碱基的点突变。     

犬细小病毒临床分离株VP2基因进化分析

为了对犬细小病毒临床分离株的VP2基因进行遗传变异分析,了解本地区犬细小病毒流行的优势型别及病毒变异情况。采集2例患犬细小病毒病的动物粪便,提取病毒基因组,设计特异性引物,PCR扩增VP2基因,对扩增产物测序,对序列结果与同属其他毒株VP2基因序列用MEGA 7和MegAlign进行同源性分析和遗传进化分析。同时比较其氨基酸变异情况。结果显示,PCR扩增出VP2基因,测序结果显示大小为1 755 bp,2株病毒VP2基因NCBI序列登录号分别为MH155192和MH155193, MH155192与MF467233.1和JQ743891.1的核苷酸同源性为99.9%,MH155193与KY937651.1、KP260509.1、KY937641.1核苷酸同源性为99.8%。MH155192主要位点氨基酸分别为为267Y,324I,370Q,426D,440A。MH155193主要位点氨基酸分别为267Y,324I,370R,426E,440T。且2株病毒297位均为A。表明分离到的2株病毒分别为新CPV-2b和CPV-2c型。     

成都地区犬细小病毒VP2基因克隆分析及基因型鉴定

根据GenBank中犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2基因序列设计合成两对特异性引物1F/1R和2F/2R,从疑似CPV感染病犬的粪便病料中提取DNA作为模板,分段扩增涵盖VP2基因的两个片段,大小分别为1325和758 bp,并进行克隆、测序,通过拼接得到11条长度为1755 bp的VP2基因完整序列。核苷酸同源性分析表明,扩增得到的11个完整VP2基因序列与GenBank中发布的21株国内外参考毒株比较,核苷酸同源性为96.2%~99.8%。采用DNAStar软件分析,预测VP2蛋白可能成为B细胞表位的区段位于Met1-Val38、Met73-Val82、Met96-Ala103、Lys151-Thr170、Gly235-Phe243、Leu294-Phe303、Ala359-Thr399、Ile469-His483、Ala503-Arg520、Lys570-Tyr584。将扩增获得的VP2基因编码的氨基酸序列与CPV参考毒株进行比较,第426位和第555位氨基酸残基分别为Asp和Val,鉴定出本试验得到的CPV基因型均为2a型,初步证实成都地区仍以CPV-2a为主要流行毒株。     

犬细小病毒上海分离株全基因的克隆及进化树分析

为研究上海地区犬感染细小病毒（Canine parvovirus,Cpv）的基因特点和基因型,参考GenBank上细小病毒3个基因型的全基因设计6对扩增引物进行PCR,分段扩增出目标片段,克隆于T载体上,测定序列并拼接,用MEGA软件、NJ法构建进化树。结果显示,犬细小病毒全基因为4758bp,命名为CPV-SH．提交到GenBank上的序列号为FJ792845,与GenBank中4神基因型爽细小病毒的VP2基因核苷酸序列同源性比较发现,CPV-SH克隆与2a亚型犬细小病毒核苷酸同源性为最高99．7％,与2型、2b亚型。2e亚型的同源性分别为98．8％、99．5％．99．5％。CPV-SH属于2a亚型犬细小病毒,与国内北京分离株CPV／BJ082亲缘关系最近,同源性为99．9％。     

突变体黑羽鹌鹑MHC classⅠ第4外显子多态性与新城疫病毒遗传抗性的关联分析

运用PCR技术扩增突变体黑羽鹌鹑MHC classⅠ基因第4外显子296bp,进行多态性分析,结果显示,该片段有18个突变位点,且均为多态基因座。试验鹌鹑3次感染新城疫病毒F48E9后产生的抗体与18个突变位点进行关联分析,结果表明,第2,4,6,13,14,15突变位点各基因型之间抗体水平差异显著或极显著,这些基因位点可作为抗病力的主要候选基因,为鹌鹑进一步抗病育种提供必要的试验依据。     

Analysis of Clone and Prokaryotic Expression of Canine Parvovirus VP2 Gene

The study was aimed to investigate the epidemic situation of canine parvovirus in Hebei and Gansu provinces.VP2 protein was expressed by prokaryotic system and polyclonal antibodies were prepared, which provided a basis for the further researches on pathogenesis and therapy of canine parvovirus.Virus genomic DNA was extracted from 10 epidemic materials of suspected infected dogs and VP2 gene was amplified.The target fragments of VP2 gene were cloned to pET-30a vector after sequencing and analysis, then the positive expression plasmids were transformed into E.coli BL21 (DE3) cell.Polyclonal antibodies were prepared by immunizing guinea pigs with the SDS-PAGE identification of purified protein.The genetic analysis results showed that the VP2 gene was successfully cloned and 80% samples were belonged to CPV-2a and 20% samples were belonged to CPV-2b.The isolated strains of the test and part of China strains were gathered into a branch which had certain distance with strains of Korea and USA, and that had low homology with strains of Italy.SDS-PAGE results indicated that the recombinant protein with a molecular weight of 70 ku was expressed by prokaryotic system.Western blotting results showed that the recombinant protein had good immuneoreactivity and immunogenicity.The study indicated that CPV-2a was the predominant gene type in Hebei and Gansu provinces, meanwhile VP2 protein expressed by prokaryotic system had good antigenicity.This research provided a basis for the future study of the prevention and control of canine parvovirus.     

番鸭源鹅细小病毒ZQ株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的鹅细小病毒(GPV)B株和GD株基因序列,应用DNA Star分子生物学软件设计一对引物,应用PCR技术扩增GPV ZQ株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。结果表明ZQ株基因大小为1 764 bp,编码587个氨基酸,其基因序列与GPV参考毒株推导的氨基酸序列同源性在89.1%~99.3%之间,差异较大;与番鸭细小病毒(MDPV)参考毒株相比同源性在92.0%~92.5%之间,超过与部分GPV毒株的同源性,推测可能与该毒株来源于番鸭而不是鹅有关,另外也在基因水平上解释了GPV与MDPV在血清学上存在交叉反应的部分原因。     

Cloning and Phylogenetic Analysis of VP2 Gene of Canine Parvovirus in Guiyang Area

This study was aimed to investigate popular genotype and phylogenesis of VP2 gene of canine parvovirus (CPV) in Guiyang area. Ten strains of viruses were isolated from Guiyang and the VP2 gene was amplified by PCR, cloned and sequenced. Results showed that the isolate virus grew could produce typical CPE in F81 cells, seven strains of CPV were CPV type 2a and others were CPV type 2c, named as GY-1 to GY-10. The nucleotide homologies of the isolated strains compared with 3 vaccine strains were 98.4% to 99.4%, with others reference strains nucleotide homologies within 97.7% to 99.9%.This research firstly reported the prevalence of CPV genotype was CPV type 2a in Guiyang area with such CPV type 2c, this was very important for monitoring the trend of CPV genetic variation and the development of vaccine.     

贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为研究贵阳地区犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）的流行基因型及其遗传进化情况,本试验对从贵阳市分离的10株CPV的VP2基因进行PCR扩增和克隆并进行序列分析。结果显示,分离的病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变（CPE）,分离的10株病毒中,7株为CPV-2a亚型,3株为CPV-2c亚型,命名为GY-1~GY-10。10株CPV分离株与疫苗株VP2基因的同源性98.4%~99.4%,与其他国内外参考株的同源性为97.7%~99.9%。本试验首次报道贵阳市CPV的流行基因型为CPV-2a亚型并伴随CPV-2c亚型存在,对监测CPV遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。     

犬细小病毒的分离鉴定

用猫肾(F81)细胞从沈阳某养犬场病死犬的肠内容物中,分离到1株细小病毒.根据犬细小病毒(CPV)VP2基因的核苷酸序列设计合成了两对特异性引物,对分离的病毒株进行PCR扩增,分别得到846 bp和815 bp的2个片段,PCR产物经纯化后测序,测序结果与GenBank中已发表的CPV参考株PLI-IV(typeFPV)、CPV-b(type2)、V154(type2a)、LCPV-V204(type2b)、LCPV-V139(type2c(a))和LCPV-V203(type2c(b))的VP2基因序列相比较,根据分析比较的数据结果,确定此株细小病毒为CPV-2a亚型.     

鹅细小病毒主要结构蛋白VP3基因的克隆与序列分析

将GPV H2分离株接种于13日龄非免疫鸭胚，收集接毒后3－7日死亡鸭胚的尿囊液。纯化病毒，通过PCR技术，从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段，经酶切鉴定后直接与pMD 18-T质粒载体连接，转化感受态大肠杆菌TG1。提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。结果表明；鹅细小病毒H1分离株VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸，与国外已发表的鹅细小病毒B株核苷酸序列同源性为98．5％，氨基酸序列同源性为98．3％，表明这二个毒株亲缘关系相近。     

鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。     

猫细小病毒CC 1株VP1基因克隆与序列分析

根据GenBank登录的猫细小病毒(CU-4)VP1基因序列,设计了1对引物,用PCR技术对VP1基因进行整体扩增,将扩增产物纯化后克隆入PGM-T载体,通过酶切、PCR和测序进行验证。结果表明,测序拼接得出VP1基因的序列长度约为2306 bp,该基因的ORF总长为2184 bp,编码727个氨基酸,应用DNAStar软件把所测得的序列与国内外代表性毒株的VP1基因编码区全长核苷酸序列和氨基酸序列进行比对分析,发现CC-1株与国内XJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.3%。     

猫细小病毒CC-1株VP1基因克隆与序列分析

根据GenBank登录的猫细小病毒(CU-4)VP1基因序列,设计了1对引物,用PCR技术对VP1基因进行整体扩增,将扩增产物纯化后克隆入PGM-T载体,通过酶切、PCR和测序进行验证。结果表明,测序拼接得出VP1基因的序列长度约为2306 bp,该基因的ORF总长为2184 bp,编码727个氨基酸,应用DNAStar软件把所测得的序列与国内外代表性毒株的VP1基因编码区全长核苷酸序列和氨基酸序列进行比对分析,发现CC-1株与国内XJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.3%。