一例猪链球菌与蓝耳病病毒混合感染的实验室诊断

安达市某猪场仔猪大批发病,病猪出现精神萎靡、呼吸困难、采食量下降、体温升高。为对该场病猪进行确诊,运用临床诊断和病理解剖等手段,初步诊断是猪链球菌和蓝耳病病毒的混合感染,病猪感染本病早产和死胎率达30%、死亡率可达80%。通过细菌学和PCR技术对放线杆菌、链球菌、猪瘟病毒、猪圆环病毒及蓝耳病病毒进行检测。发现血液琼脂培养基中出现针尖大小菌落,镜检为革兰氏阳性球菌,PCR检测蓝耳病病毒与链球菌为阳性,最终确诊为链球菌和蓝耳病病毒混合感染。通过对分离细菌进行药敏试验,结果显示,硫酸头孢喹肟、土霉素高度敏感。     

副猪嗜血杆菌、猪瘟病毒和猪圆环病毒2型混合感染的诊治

为查明吉林市郊区某猪场发生的一起疫病病因,对送检病猪进行病理剖检和实验室PCR检测,确诊为副猪嗜血杆菌、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型混合感染,经用药和采取综合防控措施后疫情得到控制。     

猪瘟、猪圆环病毒2型和多杀性巴氏杆菌混合感染的实验室诊断

2017年6月,黑龙江省大庆市某猪场爆发疾病,病程为7~10 d,临床症状主要表现为呼吸困难、病猪卧地不起、有间歇性咳嗽、食欲不良、体温升高、腹泻、病猪表皮有褐色斑点等症状。无菌采取病猪肺脏等病料提取DNA和RNA,进行聚合酶链式反应(PCR)检测,同时分离菌进行革兰氏染色镜检、生化试验和药敏试验等。PCR扩增出结果为猪瘟、多杀性巴氏杆菌和猪圆环病毒2型的混合感染。药敏试验结果显示恩诺沙星和头孢噻肟对分离菌高度敏感。     

圆环病毒和大肠杆菌混合感染导致猪死亡的实验室诊断

2019年6月中旬,黑龙江省肇东市某一猪场暴发疾病,部分保育猪突然体温升高至42℃且伴随呼吸症状,经流行病学调查可得知该猪场发病率高达75%,死亡率为15%。临床症状主要为体温升高、腹泻、表皮有褐色斑点等症状。无菌采取病猪病变部位提取DNA和RNA,进行聚合酶链式反应(PCR)检测,同时对分离菌进行药敏试验、生化试验以及革兰氏染色镜检等。PCR检测猪圆环病毒为阳性,生化试验以及革兰氏染色镜检检测分离菌为大肠杆菌,最终确诊为圆环病毒和大肠杆菌的混合感染。药敏试验结果显示分离菌对头孢噻呋和阿米卡星高度敏感。     

猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪附红细胞体混合感染病例的实验室诊断

为确诊贵州省兴义市某养殖场生猪的发病原因,分别采集病死猪组织样品进行猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒核酸检测,以及病猪耳静脉血进行血液原虫检查。结果:(1)实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟病毒核酸和PCR检测猪圆环病毒2型核酸均为阳性。其余病毒核酸检测均为阴性。(2)血涂片姬姆萨染色观察发现红细胞变形,呈齿轮状、星芒状等形态,为附红细胞体感染典型特征。结论:确诊病例为猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪附红细胞体混合感染。     

猪蓝耳病毒、猪圆环病毒2型与副猪嗜血杆菌混合感染的实验室诊断及血清抗体检测

为了确定山东省莱西市某猪场送检病猪的发病原因,并调查猪群主要疫病抗体水平以便为猪场疫病防控提供科学参考依据,试验采集送检病猪病料,综合运用临床观察、病理剖检、细菌分离鉴定和病毒核酸检测等技术进行确诊;并对分离菌进行药敏试验;使用ELISA检测试剂盒对猪群的猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)4种主要病原进行检测,分析抗体水平。结果表明:送检病料经TSA培养基分离培养可见针尖状菌落,革兰氏染色镜检为阴性杆菌,生化试验鉴定为副猪嗜血杆菌;该分离细菌对大观霉素高度敏感,对头孢噻肟极度敏感;猪群中PRRSV和PCV-2为阳性,未检测出其他病毒;同场猪群的猪瘟抗体水平偏低需加强免疫,猪蓝耳病抗体水平不稳定,存在野毒感染风险。说明送检病例为PRRSV、PCV-2和副猪嗜血杆菌的混合感染,同场猪群需注意加强猪瘟免疫和猪蓝耳病抗体监测。     

猪混合感染牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒和大肠杆菌的诊断

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)不仅感染奶牛和黄牛,还会感染猪、鹿和羊等多种动物。猪感染BVDV会出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化。本试验通过对黑龙江大庆市某猪场送检的病猪进行实验室诊断,确诊该病猪为牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒和大肠杆菌混合感染。     

仔猪蓝耳病病毒、圆环病毒和链球菌混合感染的诊断

为诊断黑龙江省某猪场暴发的猪病,采用流行病学调查、临床检查和病理剖检以及实验室检测技术,通过PCR检测、革兰氏染色、生化试验等方法对无菌采集的病料进行检测。PCR检测结果显示猪圆环病毒和蓝耳病病毒为核酸阳性条带,革兰氏染色和生化试验结果为链球菌,最终证明该群病猪为圆环病毒、蓝耳病病毒和链球菌混合感染。本文提出了一些预防保护措施,也为猪圆环病毒病和蓝耳病的防治提供了参考。     

一起育肥猪急性死亡病例的诊治

本文采用RT—PCR方法从某规模化养殖场育肥猪急性死亡病例病料中检测猪瘟病毒（CFSV）、蓝耳病病毒（PRRSV）、圆环病毒（PCV）、乙脑病毒（JEV）、伪狂犬病毒（PRV）,并进行细菌的分离,采用16s RNA对所分离的致病菌进行鉴定,鉴定结果为病猪为猪瘟病毒、蓝耳病病毒混合感染同时继发猪丹毒杆菌感染,药敏试验结果显示分离的致病菌对青霉素。头孢噻肟和先锋霉素V高度敏感。根据结果制定出相应的防治措施,经过处理后,病情得到良好的控制。     

一起“猪无名高热综合征”的诊断与防治

菏泽某猪场出现了一种以无名高热为主要特征的猪病,对发病猪场进行实地走访并采集典型发病猪病料。采用染色镜检和细菌培养等方法鉴定,结果从发病猪体内分离到大肠杆菌,药敏试验表明该菌株对氟苯尼考、头孢呋肟、先锋噻肟、氨苄西林钠高敏,对阿米卡星、庆大霉素、四环素中敏,而对链霉素、妥布霉素、复方新诺明不敏感;通过对病猪料进行实时荧光PCR检测,结果显示猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒为阳性,表明该猪场暴发的无名高热综合征是由猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒及大肠杆菌混合感染引起。     

某规模化猪场伪狂犬病的诊断

河南平顶山某猪场母猪出现较严重的流产和产死胎现象,且50日龄~70日龄仔猪出现神经症状,根据临床表现初步诊断为伪狂犬病。为排除猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟,进行了实验室诊断。应用ELISA方法检测发病保育猪及母猪血清的伪狂犬病病毒野毒株gE抗体,并对发病仔猪病料进行了伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的实时荧光定量PCR检测。结果显示,伪狂犬病病毒野毒抗体阳性,实时荧光定量PCR检测确定仔猪病料中PRV核酸阳性,PRRSV和CSFV核酸阴性。结合临床症状及实验室检测,确诊该猪场发生的是猪伪狂犬病。     

一例猪圆环病毒2型和大肠杆菌、溶血葡萄球菌混合感染的诊断

山东德州某猪场发生猪高热、呼吸系统疾病甚至死亡的疫情。采集病料提取病变组织总DNA或RNA进行猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒的PCR或RT-PCR检测。PCR扩增出353 bp的猪圆环病毒2型特异性条带。同时进行细菌分离培养、生化鉴定等试验,诊断为猪圆环病毒2型和大肠杆菌、溶血葡萄球菌混合感染。     

猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立

为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。     

圆环病毒2型人工感染猪的排毒情况及体内分布规律的初步研究

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的重要病原,它给养猪业带来巨大的经济损失。本研究利用PCR及荧光定量PCR检测猪人工感染猪圆环病毒2型后的排毒及体内分布规律。结果表明,感染猪可以通过呼吸道和消化道进行排毒,而且病毒持续存在;PCV2病毒主要存在于病猪的淋巴结、肾脏、肺脏中,在肝脏和脾脏中也少量存在。     

1例藏香猪伪狂犬病、猪圆环病毒病与附红细胞体病混合感染的诊治

为对送检的发病藏香猪病死因进行确诊,本试验采用常规PCR、RT-PCR及荧光定量PCR方法,并结合流行病学调查、临床诊断及病理剖检等实验室检测对送检病料进行诊断,结果显示病死猪心脏、肺脏充血出血,肺脏肉变,气管内充满白色泡沫,全身淋巴结出血;荧光定量PCR方法检测猪圆环病毒呈阳性,PCR方法检出猪伪狂犬病病毒特异性条带,未见猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体条带,RT-PCR方法未扩增出猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性条带;血液涂片染色镜检可见猪附红细胞体。结果表明病死猪为猪伪狂犬病、猪圆环病毒病与猪附红细胞体病混合感染,采用经实验室诊断给出的综合防治方案治疗后,疫情得到控制。本次病例的诊治为养猪业可能发生的猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、猪附红细胞体病的混合感染提供了有效的防治方法和借鉴经验。     

规模化猪场猪圆环病毒2型感染的实验室诊断

为了确诊贵州省某规模化猪场保育仔猪异常死亡原因,从怀孕母猪、产房母猪、后备母猪、种公猪、哺乳仔猪、保育仔猪6个猪群采集90份血清样本采用ELISA方法分别进行血清抗体检测,并对采集的90份血清样本和1份病死猪淋巴结组织采用荧光PCR方法进行病原学检测。结果:6个猪群综合的猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒g B蛋白、伪狂犬病病毒g E蛋白血清抗体阳性率分别为87.78%、70.00%、88.89%、4.44%;猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒病原核酸检测显示阴性,猪圆环病毒2型病原核酸检测淋巴结组织样本显示阳性。试验结果表明,引起该猪场保育仔猪死亡的原因为猪圆环病毒2型感染。同时,怀孕母猪群出现了伪狂犬病病毒g E蛋白抗体阳性,提示怀孕母猪群可能存在猪伪狂犬病野毒感染。     

猪瘟疫苗在猪圆环病毒2型阳性猪场的免疫效果观察

为了研究猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对猪瘟疫苗免疫效力的影响,对PCR证实为PCV-2阳性的试验猪进行猪瘟疫苗的免疫,分别在免疫后第1、3、7、14、21、28和63天对试验猪进行猪瘟病毒(CSFV)和PCV-2的抗体检测。检测结果表明PCV-2阳性猪在猪瘟疫苗免疫后均未能产生有效的CSFV抗体,从免疫猪的血液和内脏组织中也未能检测到CSFV核酸。虽然只能从1头PCV-2阳性猪的血清中检测到PCV-2抗体,但是却能从全部实验猪的淋巴结中检测到PCV-2的核酸。试验猪的病理组织学观察和白细胞计数也表明PCV-2阳性猪的淋巴结呈典型的PCV-2感染的病理变化,且白细胞数量显著低于健康猪。表明PCV-2的感染会对猪的免疫系统造成损害从而抑制猪瘟疫苗的免疫效果。     

5种猪病多重PCR检测方法的建立

To establish a method for simultaneous detection of classical swine fever virus (CSFV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), pseudorabies virus (PRV), porcine circovirus type 2 (PCV2) and porcine parvovirus (PPV), a multiplex PCR was developed with a set of specific primers designed based on the conserved sequences of CSFV, PRRSV, PRV, PCV2 and PPV. Under the optimized conditions of multiplex PCR,five special fragments of 167 (CSFV),433 (PRRSV),305 (PRV), 559 (PCV2) and 882 bp (PPV) were amplified with a detection limit of 220, 1.6, 72, 400 and 370 pg, respectively. But the multiplex PCR amplification results of swine influenza virus （SIV）, Japanese encephalitis virus （JEV）, Streptococcus suis （SS） and porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） were negative．The results showed that the multiplex PCR method was capable of CSFV, PRV, PRRSV, PCV2, PPV infection of single or mixed clinical samples for rapid diagnosis.     

Establishment and Application of Single and Duplex RT-PCR Method for Differentiation of Wild-type and Vaccine Viruses of Classical Swine Fever Virus

For the distinguishment of wild-type and vaccine viruses of classical swine fever (CSF),a rapid and simple method was established,which laid the foundation for the purification of classical swine fever virus (CSFV) in large-scale farms.It was found that T-rich insertion sequence independently that 3'-NTR in Lapinized vaccine strain according to the genome sequence comparative analysis of CSF wild virus,vaccine virus and near origin virus published in GenBank,on the basis of this,two pairs of specific primers were designed in the upper and lower ends of the insertion sequence and duplex RT-PCR primers were designed.The anneal temperature of polymerese chain reaction (PCR) was optimized,then the two single and duplex RT-PCR method for the differentiation of wild-type and vaccine viruses of CSF were established.The sensitivity and specificity results showed that the minimum amounts of nucleic acid by the single RT-PCR were 2.2 pg (one pair of primers in single RT-PCR)and 1.7 pg (another pair of primers in single RT-PCR),respectively,and that of the duplex RT-PCR were 8.2 pg (wild-type virus of CSF) and 6.7 pg (vaccine virus of CSF), respectively, and no amplification of PRV,PRRSV,JEV,BVDV,PCV2 DNA/RNA were detected by these methods.Then the methods were used to detect 146 suspicious clinical samples,and the results showed that the positive rates of the mixed infection by wild-type and vaccine viruses of CSF in breeding sows,fattening pigs,nursery pigs and suckling piglets were 6.3%,7.4%,8.3%,8.6%, respectively.The results indicated that the single and duplex RT-PCR methods had high specificity,sensitivity,and good repeatability,and it had an important reference value for the purification of CSF in large-scale farms.     

鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的单一与二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种对猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）临床样本快速、简便的检测技术,以区分猪瘟（classical swine fever,CSF）野毒和疫苗毒感染,为规模化猪场CSF净化奠定基础。通过对GenBank中CSF野毒、疫苗毒及近源病毒的基因组全序列比对,发现CSF兔化弱毒疫苗株3’-NTR独立存在富含T的插入序列,根据这一特点分别在该插入序列的上、下两端设计2对单一RT-PCR引物并选择特异保守区域设计了二重RT-PCR引物,优化筛选能够鉴别CSF野毒与兔化弱毒疫苗的PCR反应条件,建立了能鉴别CSF野毒和疫苗毒的单一与二重RT-PCR鉴别诊断方法。敏感性和特异性分析表明,单一RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为2.2 pg（单一RT-PCR中的1对引物）和1.7 pg（单一RT-PCR中的另外1对引物）;二重RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为8.2 pg（CSF野毒）和6.7 pg（CSF疫苗毒）,两种方法均检测不到PRV、PRRSV、JEV、BVDV、PCV2的DNA/RNA。采用该方法对146份可疑临床样品进行检测,结果表明CSF疫苗毒与野毒在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的二重感染率分别为6.3%、7.4%、8.3%、8.6%。本研究建立的单一与二重RT-PCR方法都具有敏感性强、特异性优、重复性好的特点,该研究对规模化猪场猪瘟的净化具有十分重要的参考价值。