副猪嗜血杆菌实时荧光PCR快速检测方法的建立和应用

[目的]建立一种快速准确定量检测副猪嗜血杆菌（HPS）的检测方法。[方法]根据GenBank公布的副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因序列,选择其保守区域设计1对特异性引物。通过优化引物浓度和退火温度,建立快速定量检测副猪嗜血杆菌的实时荧光PCR方法,并评价了其特异性和稳定性。[结果]建立的实时荧光PCR方法最低检测限是50拷贝/μl,重复性好,变异系数均小于2%。该方法特异性强,只能检测副猪嗜血杆菌,不能检测到猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α和猪伤寒沙门氏菌。采用该方法对10份临床疑似HPS感染样本进行检测,其结果与细菌分离培养和常规PCR的结果一致。[结论]建立的实时荧光PCR方法快速、灵敏、特异、重复性高,可用于HPS感染的临床快速检测。     

副猪嗜血杆菌广西分离株耐药性分析

为了了解广西副猪嗜血杆菌(HPS)的耐药情况,试验应用纸片扩散法测定了2009年5月份至2011年3月份分离自广西壮族自治区南宁、桂林、玉林、钦州市65个猪场的31株副猪嗜血杆菌药物敏感性。结果表明:31株菌株对罗红霉素、多黏菌素B和链霉素的耐药率为58.1%、54.8%和51.6%;对头孢西丁、阿莫西林、氨苄西林、卡那霉素、阿米卡星、新霉素、环丙沙星、恩诺沙星的耐药率为16.1%～41.9%;对庆大霉素、氟苯尼考和头孢噻肟的耐药率只有6.5%、9.7%和9.7%。在31株HPS广西分离株中,只有1株菌株对14种抗菌药敏感,仅占3.2%;4株菌株只对1种抗菌药产生耐药性,占12.9%;其余26株菌株对2种以上抗菌药产生耐药性,占83.6%。     

应用PCR技术鉴定猪鼻支原体的感染

2009年8月份至2010年6月份,广西贵港市、北流市和南宁市3个规模化猪场保育猪陆续出现体温升高、关节肿大、心包炎和腹腔炎等疑似副猪嗜血杆菌病症状,部分病猪发生死亡,为了研究其病原,试验应用PCR技术对病猪肺渗出物和关节液提取的DNA模板进行细菌16S rRNA基因的PCR扩增和测序。结果表明:引起广西省3个规模猪场出现疑似副猪嗜血杆菌病症状的病原是猪鼻支原体。     

大肠杆菌O157:H7氟苯尼考耐药菌株与敏感菌株的蛋白组学差异

[目的]分析大肠杆菌O157:H7氟苯尼考耐药菌株与敏感菌株的差异表达蛋白,从蛋白组学层面揭示大肠杆菌O157:H7对氟苯尼考耐药性的产生机制.[方法]提取大肠杆菌O157:H7氟苯尼考耐药菌株(RS2-256)和敏感菌株(RS2)的全菌蛋白,经同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)标记后进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析,质谱数据通过Mascot v2.2鉴定,并根据COGs数据库对差异表达蛋白进行GO功能注释和分类.[结果]RS2菌株获得3385个肽段,RS2-256菌株获得3955个肽段,合计7340个肽段,其中6975个肽段为特有肽段,分属于1039个蛋白.与RS2菌株相比,RS2-256菌株有145个蛋白表达差异显著(P<0.05),占检测蛋白总数的13.96%,其中,上调表达蛋白有87个、下调表达蛋白有58个.表达差异蛋白按照功能进行分类,可分为外排泵、转运蛋白、细胞膜形成、应激调控、核糖体结构、DNA复制、转录、翻译、翻译后修饰、能量产生和转化、氨基酸转运和代谢、辅酶转运和代谢、糖转运和代谢、脂肪代谢、离子转运和代谢、细菌运动性、转座及信号通路共18类;多药物外排泵亚基AcrA和AcrB、外膜蛋白TolC、外膜蛋白X等52个蛋白的表达变化在3.00倍以上,占表达差异蛋白总数的35.86%.[结论]外排泵AcrAB-TolC家族、ABC家族、外膜蛋白、毒性调节器B、饥饿蛋白等在大肠杆菌O157:H7对氟苯尼考耐药性产生过程中发挥重要作用,同时涉及细菌糖代谢、氨基酸代谢、离子转运、DNA损伤与修复、生物膜及毒素与抗毒素系统等生命活动.     

副猪嗜血杆菌病原检测及aroA基因PCR-RFLP分型

本试验应用PCR方法及PCR-RFLP技术对aroA基因在副猪嗜血杆菌病原检测及基因分型中的作用进行探讨。以针对aroA基因的PCR引物成功检测出18株来自广西各地区猪场的副猪嗜血杆菌,敏感性检测结果表明,该PCR方法可检测的最低菌数为10²个。对该18株副猪嗜血杆菌进行aroA基因的序列测定,并进行aroA基因的酶切位点分析,筛选出Hind Ⅲ和FokⅠ两种限制性内切酶,利用PCR-RFLP技术对1株血清5型参考菌株与本研究中18株广西菌株aroA基因的完整编码序列进行Hind Ⅲ和FokⅠ限制酶谱分析,结果显示可分为与毒力相关的3种谱型。本研究结果表明,应用PCR方法及PCR-RFLP技术对副猪嗜血杆菌进行检测分析有助于更好地研究副猪嗜血杆菌的生物学特性及aroA基因的功能。     

猪瘟疫苗在猪圆环病毒2型阳性猪场的免疫效果观察

为了研究猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对猪瘟疫苗免疫效力的影响,对PCR证实为PCV-2阳性的试验猪进行猪瘟疫苗的免疫,分别在免疫后第1、3、7、14、21、28和63天对试验猪进行猪瘟病毒(CSFV)和PCV-2的抗体检测。检测结果表明PCV-2阳性猪在猪瘟疫苗免疫后均未能产生有效的CSFV抗体,从免疫猪的血液和内脏组织中也未能检测到CSFV核酸。虽然只能从1头PCV-2阳性猪的血清中检测到PCV-2抗体,但是却能从全部实验猪的淋巴结中检测到PCV-2的核酸。试验猪的病理组织学观察和白细胞计数也表明PCV-2阳性猪的淋巴结呈典型的PCV-2感染的病理变化,且白细胞数量显著低于健康猪。表明PCV-2的感染会对猪的免疫系统造成损害从而抑制猪瘟疫苗的免疫效果。     

羊源肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

本研究通过病死羊的肺脏中进行细菌分离、形态学观察、生化试验、致病性试验、药敏试验和16S rRNA扩增。结果从肺中分离到1株具有致病性的革兰氏阴性短杆菌。生化试验鉴定结果符合肺炎克雷伯氏菌的特征。分离株对头孢噻肟、阿米卡星、头孢曲松和链霉敏感外,对强力霉素等12药物具有耐药性。16S rRNA测序结果分析显示分离株与肺炎克雷伯氏菌的核苷酸同源性为97.1%~99.0%,在核苷酸进化树上与肺炎克雷伯氏菌属于同一分支。结果表明本研究从病死羊的肺脏中分离到1株肺炎克雷伯氏菌。     

广西地区副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱分型研究

为探讨肠道细菌基因间重复序列(ERIC)的聚合酶链反应(PCR)技术用于副猪嗜血杆菌基因分型的可行性,对分离自广西地区不同猪场的22株副猪嗜血杆菌进行ERIC-PCR指纹图谱分型研究.结果发现,22株分离株显示出12种指纹图谱,可以区分无法进行血清分型的菌株.表明ERIC-PCR可适用于对副猪嗜血杆菌进行分子流行病学调...     

大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测试剂盒的研制

为了研制一种快速、准确诊断大肠杆菌O157:H7的PCR方法,试验根据GenBank收录的大肠杆菌O157:H7全基因组序列,设计并合成了2对可扩增rfbE(O157)和Flic(H7)基因片段的特异性引物,建立双重PCR快速检测大肠杆菌O157:H7的方法,并研制出检测试剂盒。结果表明:该检测试剂盒对大肠杆菌O157:H7能特异性地扩增出rfbE和Flic基因的目的片段;对大肠杆菌O157:H30、O157:H9、O157:H25、O157:H19只能扩增出rfbE而不能扩增出Flic基因的目的片段;对大肠杆菌DH5α、猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌没有扩增出任何目的片段;细菌DNA的最低检测极限是50 pg;在-20℃条件下保存1,3,6,9,12个月后,其敏感性都没有发生改变,均能检测到50 pg的大肠杆菌O157:H7DNA模板。     

鸭疫里默氏杆菌菌体蛋白双向电泳技术的建立

为了建立鸭疫里默氏杆菌菌体蛋白的双向电泳技术,获得分辨度高、重复性好的双向电泳图谱。利用适当的裂解液处理鸭疫里默氏杆菌,提取全菌蛋白;采用pH值4～7,24cm干胶条,0.8 mg菌体蛋白进行双向电泳;硝酸银染色后获得的双向电泳图谱,并利用I mage MasterTM2D Platinum5.0图象分析软件进行分析,所得的数据用SPSS 15.0软件进行统计分析。结果得到了(800±26)个蛋白斑点,蛋白主要集中在pI值4.13～7.40之间,重复胶的匹配点数为(600±20),匹配率为75.2%。建立了鸭疫里默氏杆菌菌体蛋白双向电泳技术,2-DE图谱中蛋白位点的分辨率和重复性比较高,为进一步研究其蛋白质组学奠定了基础。