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为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。 相似文献
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猪ASC及Ub基因的克隆及真核表达重组质粒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
炎症小体不仅参与机体的天然免疫反应,同时还参与机体抗病毒等多种宿主防御反应。在多种疾病相关信号通路反应中都伴随着蛋白质的泛素化修饰。NOD样受体(NLRs)介导的炎症小体信号通路中,凋亡相关点状样蛋白(ASC)是关键的接头蛋白。为了解猪瘟病毒(CSFV)感染对ASC泛素化水平的影响,通过RT-PCR从猪血管内皮细胞(ECs)中扩增获得ASC和泛素(Ub)的全长cDNA双链片段,连接至克隆载体pMD-18T,获得重组克隆质粒pMD-ASC和pMD-Ub。双酶切pMD-ASC获得ASC目的序列,连接至pcDNA3.1-Flag,双酶切pMD-Ub获得Ub目的序列,连接至pcDNA3.0-HA,获得重组表达质粒pcDNA3.1-Flag-ASC和pcDNA3.0-HA-Ub。将pcDNA3.1-Flag-ASC和pcDNA3.0-HA-Ub转染ECs,Western blot在蛋白水平检测ASC和Ub的表达。结果表明,成功构建了带有Flag标签的ASC真核表达质粒和带有HA标签的Ub真核表达质粒,且在ECs中获得高效表达,为进一步体外研究CSFV调控猪血管内皮细胞ASC泛素化的机制提供了实验基础。 相似文献
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