猪圆环病毒2型广东分离株的基因序列分析

【目的】本文研究了广东猪圆环病毒2型(PCV2)基因的遗传变异。【方法】采集来自不同猪场疑似PMWS的组织样品15份,用PK-15细胞增殖病毒,并进行间接免疫荧光试验鉴定,采用PCR方法扩增PCV2全基因组序列,分析其核苷酸和氨基酸序列的变异情况。【结果】GD-1和GD-2属于PCV2d亚型,其基因组由1767个核苷酸组成;GD-3,GD-4和GD-5属于PCV2a亚型,基因组由1768个核苷酸组成。5个分离株的核苷酸序列同源性为95.0%~99.9%;PCV2分离株ORF1的核苷酸和氨基酸序列高度保守,其同源性分别为96.8%~100%和99.4%~100%;GD-1和GD-2由702个核苷酸组成,编码233个氨基酸,GD-3、GD-4和GD-5由705个核苷酸组成编码234个氨基酸,5个分离株ORF2的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.9%~99.9%和88.0%~100%。【结论】广东省确实存在PCV2,但可能存在由PCV2b到PCV2d的变异。因此,有必要进一步研究PCV2基因变异对其致病性与Cap蛋白抗原性的影响,为培育和筛选更为有效的疫苗株奠定基础。     

菠萝杆状DNA病毒的全基因组序列测定及分析

【目的】证明中国湛江地区菠萝上是否存在菠萝杆状DNA病毒(Pineapple bacilliform comosus virus,PBCoV),并获得PBCoV的基因组全序列,分析该病毒与其它Badnavirus病毒分离物间的分子差异。【方法】设计特异引物,通过反向PCR及分段克隆两种方法扩增PBCoV,克隆后测序获得PBCoV基因组全序列,利用不同生物学软件进行序列分析。【结果】PBCoV基因组为环状结构,全长7543bp;含有3个典型的ORFs,推测其编码蛋白的分子量分别为20.4、14.0和217.6kD。其基因组与GenBank登录的PBCoV ORF3部分核苷酸序列同源性87%-97%,其ORF3编码的氨基酸序列与已报道的Badnavirus病毒ORF3氨基酸序列间一致率小于50.8%。Southern blot分析显示该病毒基因组能整合到植物基因组中。【结论】在中国湛江地区菠萝上存在PBCoV,该病毒属于Badnavirus属病毒,与香蕉线条病毒(Banana streak virus)Mys分离物(BSV-Mys)亲缘关系最近。这是PBCoV基因组全序列的首次报道。     

TBTV卫星RNA不同分离物的序列测定及系统进化分析*

  利用RT-PCR方法对烟草丛顶病毒（tobacco bushy top virus,TBTV）卫星RNA不同分离物进行扩增和克隆测序,同时运用DNAMAN,MEGA,ClustalX等生物软件对TBTV和其它幽影病毒的卫星RNA核苷酸序列进行同源性比较,构建了幽影病毒属成员卫星RNA的系统进化树。E结果显示：TBTV不同分离物卫星RNA的核苷酸同源性为792%～990%。它们与幽影病毒属其它成员卫星RNA的核苷酸同源性为325%～441%。通过构建幽影病毒属成员卫星RNA的系统进化树可以看出：TBTV的卫星RNA与GRV的卫星RNA亲缘关系最近,与CMoMV的亲缘关系最远。     

5株PCV2四川株全基因组的克隆与遗传进化分析

【目的】了解目前四川省猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学特征和遗传变异情况,探讨PCV2感染的控制对策。【方法】根据GenBank中发表的PCV2基因组序列设计2对特异性引物,对2012-2014年临床送检的PCV2感染病例材料中的5株PCV2全基因组序列进行扩增测序,并利用DNAStar等生物信息分析软件对获得的PCV2基因组序列进行分子特性与遗传演变分析。【结果】5株PCV2四川株全基因组序列长度都为1 767bp,均具有滚环复制起点(ORC)典型结构。序列比对和进化分析显示,5株PCV2四川株的基因序列同源性很高,基因组核苷酸序列及ORF1、ORF2和ORF3基因序列同源性分别为98.4%~99.9%,97.5%~99.6%,99.4%~100%和96.2%~100%,ORF1、ORF2和ORF3基因推导氨基酸序列同源性分别为98.4%~99%,99.6%和91.5%~100%;与47条参比PCV2毒株核苷酸序列的同源性比较发现,5株PCV2与国内一些新出现的PCV2毒株亲缘关系较近,且均属于PCV2d基因型毒株。【结论】5株PCV2四川株之间尽管存在着不同程度的基因变异,但遗传进化相对较稳定。     

野猪源与家猪源PRRSV陕西分离株全基因测序与遗传进化分析

【目的】研究野猪源与家猪源猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,PRRSV)陕西分离株的遗传变异情况及分子生物学特征。【方法】根据VR-2332和HB-1(sh)/2002毒株序列设计引物,对2株PRRSV陕西分离毒株Shaanxi-1(家猪源)、Shaanxi-2(野猪源)全基因分段进行扩增并测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因,然后进行序列的比对分析。【结果】PRRSV Shaanxi-1、Shaanxi-2毒株高度同源且均属于美洲型毒株,它们与2006年以前分离的毒株相比存在明显差异(与BJ-4株的核苷酸同源性仅为89%),而与高致病性PRRSV(HP-PRRSV)保持较高的同源性(相似率为99%左右)。Shaanxi-1、Shaanxi-2分别呈现不同的变异特点,Shaanxi-1 ORF3、ORF5基因变异较大,ORF6、ORF7较为保守;Shaanxi-2 ORF7基因变异最大,ORF3~ORF6较为保守。分析发现,Shaanxi-1、Shaanxi-2具有HP-PRRSV的分子特征,但部分位点氨基酸的突变明显区别于HP-PRRSV。【结论】不同来源的Shaanxi-1、Shaanxi-2毒株均属于HP-PRRSV演化中的一个分支,但其发生了部分变异,使其具备了新的特点。     

2株兔出血症病毒全基因测定与遗传进化分析

对2株兔出血症病毒(RHDV)SCH04、Sch07进行全基因组序列测定,并进行同源性及遗传进化分析。按照病毒核酸组成,将病毒基因分7段进行RT-PCR扩增,将分段扩增产物分别克隆到p MD-19T载体进行测序,用DNAStar进行拼接,得到全基因组序列;参照Gen Bank上登陆的31株RHDV毒株全基因核苷酸序列、VP60基因核苷酸序列以及ORF2编码基因核苷酸序列对2株病毒进行同源性和遗传进化分析。结果显示,SCH04基因组全长7 439 bp,Sch07基因组全长7 438 bp,2株病毒全基因的核苷酸序列同源性为99.8%,与31株参考毒株全基因的核苷酸序列同源性为78.3%~97.0%;2株病毒的VP60基因核苷酸序列同源性为99.7%,ORF2编码基因核苷酸序列同源性为99.2%。进化树显示2株病毒同属于抗原变异株RHDVa(GI.1a)基因群,且亲缘关系最近。VP60基因核苷酸序列与ORF2编码基因核苷酸序列均可以作为RHDV遗传进化分析。     

2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1 767bp,与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92.6%~99.9%,2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96.0%,与PCV1核苷酸序列同源性分别为74.6%和77.7%。系统进化树分析结果显示,2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近;PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2,ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a,JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。     

来源于西洋梨的苹果茎沟病毒分离物基因组分子特性研究

为了获得来源于西洋梨红贝雷沙寄主潜带苹果茎沟病毒(ASGV)分离物的基因组全长序列,并明确其分子特性,采用RT-PCR、RACE末端克隆及生物信息学方法,对ASGV分离物基因组全长进行序列测定,并对其序列特点进行分析。结果发现,来源于西洋梨的ASGV-HB分离物的基因组全长序列为6 496 nt(Gen Bank登录号:KU605672),含有2个开放阅读框ORF1、ORF2及2个可变区Ⅵ、Ⅶ。序列分析表明ASGV-HB与Gen Bank登录的18个ASGV分离物的基因组全长核苷酸序列同源性为80.6%~87.7%;ORF1和ORF2编码的氨基酸同源性分别为84.3%~92.3%和94.4%~98.7%;Ⅵ和Ⅶ可变区的氨基酸序列同源性分别为22.9%~68.8%和48.8%~92.2%;系统发育树分析显示,来源于不同国家的相同寄主的ASGV分离物聚集为同一分支。结果表明,ASGV的分子变异无地域相关性,具有一定的寄主选择性,研究结果为进一步探究ASGV的群体遗传进化机制及其防治提供了重要的分子信息。     

三株猪2型圆环病毒甘肃分离株的全基因组序列分析

根据GenBank中发表的猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法对来自甘肃不同猪场的3份病料中的PCV2进行基因的扩增、克隆和测序,得到全基因组长度为1 768 bp的PCV2Ww株(登录号DQ322701)以及全基因组长度为1 767 bp的PCV2 LZ株和TS株(登录号DQ363860和DQ355153).应用DNAstar软件序列分析可得,3个分离株全基因组与国内外参考毒株核苷酸序列同源性在94.8%~99.4%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.4%~99.4%;PCV2分离株与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69.0%~70.0%;ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为99.0%~99.4%和92.7%~98.7%.进化树分析表明,PCV2分离毒株在进化上存在地域上的相关性.     

中国水稻条纹病毒两个亚种群代表性分离物全基因组核苷酸序列分析

 首次测定了中国水稻条纹病毒(RSV)常年流行区云南楚雄　(CX)分离物及病害暴发区江苏洪泽　(HZ)分离物全基因组核苷酸序列,其中CX 分离物全长为17 093　nts,HZ分离物全长为 17 150　nts。与已报道的日本T分离物全长序列(17 145　nts)相比较,CX分离物变异较大。3个分离物基因组结构组成一致,5′端和3′末端非编码区最为保守;7个编码区保守性次之;变异主要发生在IR上。同源性分析表明,HZ分离物与日本T分离物的亲缘关系较中国2个分离物间的亲缘关系更为接近,这表明HZ和CX分离物基     

口蹄疫病毒基因组的遗传变异剖析

 【目的】明确口蹄疫病毒基因组的结构特征及其变异与结构、功能的关系以及系统发生关系。【方法】利用DNAstar和Clustalx程序进行184个口蹄疫病毒基因组序列的同源性分析、多重排比。【结果】口蹄疫病毒基因组ORF大小有所差异,范围为6 963～7 120 nt,编码2 320～2 339 aa的多聚蛋白。核苷酸和氨基酸序列的同源性,7个不同血清型间＞77.6%和＞78.3%,本研究发现了可能和生物学功能相关的新的保守和变异区域。【结论】口蹄疫病毒RNA的变异类型丰富和多样性程度较高,自然界存在的毒株可能大于血清学和测序发现的FMDV的毒株数目。     

鸡新城疫病毒分离株F基因的分子特性分析

【目的】对新城疫病毒(NDV)分离毒株进行分子特征分析,了解免疫鸡群发生新城疫的原因。【方法】用非免疫鸡胚从病鸡肺脏中分离新城疫病毒;参考GenBank上发表的NDV的F基因序列设计引物,应用RT-PCR方法对新城疫病毒分离株进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行F基因核苷酸及推导氨基酸序列分析。【结果】从发病鸡群中分离到6株NDV,分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%;分离毒株与参考毒株的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%;分离毒株F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;6个分离株均属NDV基因Ⅶ型。【结论】NDV分离株的F基因已经发生明显变异,与La Sota、Clone-30、V4等常用疫苗株在遗传进化上的亲缘关系较远,这可能是免疫鸡群发生新城疫的重要原因之一。     

鸡传染性支气管炎病毒澳大利亚T株S1全基因的克隆与序列分析

【目的】研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)澳大利亚T株S1基因全序列。【方法】采用RT-PCR技术,对IBV T株S1基因进行扩增、克隆和测序。【结果】测序结果表明,IBV T株S1基因大小为1 739 bp。与Gen-Bank中的29株IBVS1基因进行比较发现,IBV T株与吉林疫苗株(JAAS)S1基因核苷酸同源性为99.8%,有4个核苷酸的差异,其中有3个碱基发生非同义突变,氨基酸同源性为99.4%;与其余28株IBVS1基因核苷酸同源性为73.8%~84.4%,氨基酸同源性为66.8%~85.9%。进化分析发现T株与JAAS株之间的亲缘关系很近,与其他IBV株的亲缘关系均较远。【结论】JAAS株是T株的变异病毒,IBV T株的变异病毒在我国存在。     

PCV-2陕西株ORF2基因的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆猪圆环病毒2型陕西分离株(PCV-2SX株)ORF2基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的PCV-2ORF2基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,应用PCR方法扩增PCV-2SX株ORF2全长基因,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。然后,将ORF2基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。【结果】扩增到了702bp的PCV-2ORF2全长基因。序列分析结果表明,PCV-2SX株ORF2基因与广西分离株(EF675237,ChinaGX)和巴西分离株(DQ861802,am21)的核苷酸序列同源性均达98.0%,氨基酸序列同源性均达98.3%,与其他毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在89.9%～97.9%和88.5%～98.0%。SDS-PAGE可检测到分子质量约为48ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。Western-blotting分析表明,重组蛋白可被PCV-2阳性血清所识别。【结论】成功克隆了PCV-2SX株ORF2基因,并进行了原核表达。     

中国野生柑橘上衰退病毒分离株分子特征分析

 【目的】了解中国野生柑橘上携带柑橘衰退病毒（CTV）分离株的CP/HinfⅠRFLP组群构成和分子特征。【方法】运用RT-PCR对采自中国云南、广西、四川、湖南、江西等省11个野生柑橘上CTV分离株的病毒衣壳蛋白基因(CPG)进行扩增，利用RFLP和SSCP对CPG进行分析，并将测定的CPG序列进行同源性比较和聚类分析。【结果】发现野生柑橘上11个CTV分离株以单一组群感染为主；这些CTV分离株CPG的核苷酸序列和相应的氨基酸序列同源性分别为92.5％～99.5％和95.0％～100％；与GenBank收录的9个全基因组CTV分离株的相应基因序列进行聚类分析，其核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为92.1％～98.8％和94.6％～100％。【结论】序列同源性比较说明CTV CPG具有高度保守性，同时系统进化分析表明收集到的野生CTV分离株与国外分离株分属5大类群，具有较复杂的亲缘关系。     

四川番茄黄化曲叶病病原分子鉴定及变异分析

 【目的】明确引起四川番茄黄化曲叶病（Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD）的病原。【方法】对采自四川攀枝花市田间表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄植株SC64-67,通过PCR、克隆及测序等技术获得病毒及卫星DNA的全基因组序列,并对序列进行变异分析。【结果】利用双生病毒简并引物PA/PB从4个样品中均扩增得到约500 bp的片段,随机选择SC65进行DNA-A全基因组扩增和序列测定,该DNA分子全长为2 732 nts,系统进化分析表明,其与已报道的中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV）来自云南元谋的菜豆分离物（TYLCCNV-Bean-YM）的核苷酸序列相似性最高,为96.0%。检测发现,所有分离物均伴随有卫星DNAβ分子。全序列测定表明SC65 DNAβ全长1 338 nts,与分离自云南楚雄番茄上的TYLCCNV-Y25伴随的卫星DNAβ亲缘关系最近,核苷酸序列相似性为77.5%。【结论】研究表明四川番茄黄化曲叶病样品均受到TYLCCNV/DNAβ病害复合体的侵染,但其病毒DNA-A和卫星DNAβ分子来源于TYLCCNV的不同分离物。     

1个台湾番茄曲叶病毒温州分离物的全基因组序列

从浙江温州田间表现曲叶症状的番茄叶中提取获得病毒分离物wzh,对wzh全基因组序列进行测定。结果表明:wzh全长2 740个核苷酸,具有菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒基因组典型特征,共编码6个开放阅读框(open reading frame,ORF),病毒链编码AV2及AV1 2个ORFs,互补链编码AC1、AC2、AC3及AC4 4个ORFs。BLAST搜索结果显示,wzh与Begomovirus中来自亚洲的病毒同源性较高,而与美洲、非洲等地的相对较低,与台湾番茄曲叶病毒(Tomatoleaf curl Tai wan virus,ToLCTWV)DNA-A全序列同源性最高,为99%。全序列系统进化关系树显示,wzh与TolCTWV的亲缘关系最近,并形成一个独立的分支,而与其他19种双生病毒的亲缘关系均相对较远。因此,wzh是台湾番茄曲叶病毒的一个分离物。     

鸽源新城疫病毒陕西分离株P基因的克隆及序列分析

【目的】对鸽源新城疫病毒(NDV)陕西分离株P基因进行克隆和序列分析,为研究P基因及V基因的功能奠定基础,并为防治新城疫提供科学依据。【方法】参考GenBank发表的NDV基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因的全长片段,并进行克隆、序列测定和分析。【结果】NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因全长1 451 bp,其完整的ORF长度为1 188 bp,编码395个氨基酸。同源性比较可知,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与其他分离株P基因的核苷酸序列同源性在63.6%~92.9%,推导的氨基酸序列同源性在67.7%~92.2%。系统发育进化树表明,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与鸽源分离株P68亲缘关系最近,与F48E9和La Sota毒株处于进化树的不同分支。【结论】NDV/Pigeon/ShX/China/2003与国内外已报道的NDV毒株间存在较大变异。     

鸭坦布苏病毒江西分离株全基因组序列分析

为了解江西省鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)的遗传变异情况,对2013年江西省某蛋鸭场分离获得的1株鸭坦布苏病毒(命名为YF株)进行基因组分子特征及遗传进化分析。序列分析表明,该株病毒基因组全长10 990nt,未出现核苷酸插入或缺失及基因重组的变异情况,与已报道的DTMUV分离株的核苷酸同源性均在98.5%以上,且亲缘关系与当前鸭群中优势病毒亚群非常近。以上结果表明,近年来江西鸭群中流行的鸭坦布苏病毒遗传比较稳定,未发生变异。     

苹果锈果类病毒内蒙古金红分离物的基因组序列分析

【目的】研究苹果锈果类病毒内蒙古金红分离物的基因组序列,为苹果锈果类病毒的有效防控提供参考。【方法】鉴定内蒙古自治区园艺研究院实验农场果实表现花脸的金红苹果叶片是否被苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)侵染。提取植物总RNA并以获得的总RNA为模板合成cDNA第一链,通过RT-PCR技术检测样品中的ASSVd,并经克隆测序获得ASSVd内蒙古金红分离物全基因组序列。采用MEGA 6.0、DNAMAN软件对不同寄主和不同地区来源的ASSVd分离物核苷酸序列进行分析,利用线上工具RNA Folding Form预测ASSVd内蒙古金红分离物的RNA二级结构。【结果】在疑似感病内蒙古金红苹果叶片样品中检测到ASSVd。ASSVd内蒙古金红分离物的序列长度为330 nt（GenBank登录号MZ476527）,与ASSVd新疆梨分离物（JX861258）的亲缘关系最近,核苷酸序列一致性也最高,为97.9%;其次与ASSVd内蒙古塞外红苹果分离物（MN598205）的亲缘关系较近,序列一致性为97.0%;与ASSVd内蒙古塞外红苹果分离物（MN598204）的核苷酸一致性最低,为87.5%。系统发育分析显示,ASSVd的遗传关系与寄主和地理来源相关性不大。多重对比分析结果表明,ASSVd的变异主要集中在左末端区、致病区和中央保守区。RNA Folding Form预测ASSVd内蒙古金红分离物RNA基因组具有杆状二级结构,自由能为-499.49 kJ/mol。【结论】内蒙古金红苹果样品被ASSVd侵染,获取了其基因组序列相关信息。