种番鸭源禽坦布苏病毒分离鉴定及基因组序列分析

种番鸭是否感染禽坦布苏病毒颇受国内学者关注。本研究于国内外首次自表现产蛋下降的种番鸭卵巢中分离获得1株病毒（命名为WYZLJ-1359株）,经RT-PCR方法鉴定为禽坦布苏病毒。经比较分析该病毒与我国其他禽源分离株全基因组序列表明,种番鸭源分离株WYZLJ-1359主要分子特征未出现变异,与2010年以来我国分离的其他禽源分离毒株的核苷酸序列同源性均在98.4％以上,且亲缘关系非常近,遗传距离均在1.8％以下,远低于与2000年以前分离的坦布苏病毒分离株之间的遗传距离。以上结果表明,我国禽坦布苏病毒感染的宿主在不断增加,但病毒在不同品种家禽的传播过程中遗传较为稳定,基因组未出现基因的缺失或插入等变异现象。     

鸭坦布苏病毒的分离和PCR鉴定

鸭坦布苏病是危害养鸭业最严重的传染病之一。从某鸭场的疑似鸭坦布苏病病死鸭中分离到1株病毒,并对该毒株进行PCR鉴定和序列分析。结果显示,分离株的序列与Gen Bank上登录的DTMUV序列的同源性在99%以上,表明分离的病毒为鸭坦布苏病毒。     

白羽半番肉鸭坦布苏病毒的分离鉴定及结构蛋白基因分析

自肝脏表现不规则出血的白羽半番肉鸭脏器中分离获得1株病毒(命名为ZZ40株),经(RT-)PCR检测为鸭坦布苏病毒,可被鸭坦布苏病毒高免阳性血清特异性中和。应用鸭坦布苏病毒特异性引物从该株病毒基因组中成功获得结构蛋白基因片段,该片段与近年来我国分离的禽源坦布苏病毒株核酸序列同源性均在99.1%以上,而与蚊媒源坦布苏病毒MM-1775株同源性仅为88.6%;分子进化分析表明该株病毒与BYD-1等近年来的鸭坦布苏病毒分离株共处于一个进化分支。以上结果表明,我国白羽半番肉鸭存在坦布苏病毒感染,且该分离毒株的抗原性与我国早期分离于种(蛋)鸭的坦布苏病毒差异不明显。     

鸭坦布苏病毒江门株的分离鉴定及其E基因系统进化分析

从2011年江门新会区某养鸭场产蛋下降鸭群中分离出1株鸭坦布苏病毒,命名为JM株。经RT-PCR检测、透射电镜形态学观察及动物回归试验,证明该病毒是引起该场蛋鸭群产蛋下降的病原。对该病毒E基因进行序列对比、进化分析后发现,JM株与我国华东地区最早发生的鸭坦布苏病毒亲缘关系最近,核苷酸相似性达99.1%以上,表明该病毒可能来自华东地区。     

鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析

[目的]2012年10月徐州地区某鸭场的樱桃谷种鸭突然发生产蛋下降,疑似鸭坦布苏病毒病.为了确诊病因,本试验进行了剖检与病原的分离鉴定.[方法]将病料匀浆处理后尿囊腔接种SPF鸡胚,分离病毒,接种BHK细胞培养,应用RT-PCR扩增病毒全基因,测序并进行基因进化分析.[结果]分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株.该病毒株能适应鸡胚,无血凝活性,在BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU·mL-1.测序结果表明该病毒株基因组全长为10 990 nt,编码的多聚蛋白含3 426个氨基酸.DTMUV XZ-2012株与BYD株、YY5株和JS_2010株等分离株的全基因同源性为98.5％ ～99.3％.与最早分离的BYD株等相比,XZ-2012株的基因变异主要分布于E基因、NS1基因、NS2基因和NS5基因,提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力.[结论]本试验成功分离鉴定了一株鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒候选疫苗株的筛选及病毒分子流行病学研究提供了参考信息.     

安徽农业大学王桂军教授课题组首次在我国鹅群中发现新型鸭坦布苏病毒变异株

正鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus, DTMUV)自2010年在我国首次报道以来,已迅速传遍我国各大水禽养殖地区,给水禽养殖业带来重大经济损失。鸭坦布苏病毒在多年来不断发生变异,给防治带来困难。近日,安徽农业大学王桂军教授课题组一项研究发现一种新型的强毒力鸭坦布苏病毒在我国出现,并首次在雏鹅中传播。王桂军教授课题组在临床研究中发现感染鸭坦布苏病毒的鹅群表现出明显的神经症状。     

一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

2010年我国爆发了使蛋鸭产蛋量急剧下降、由一种鸭黄病毒引起的疾病,通过对来自山东某发病鸭场的病料进行分离,得到实验室分离株Du/CH/LSD/110128。对其进行全基因组序列测定分析,确定该株病毒全基因组含有一个开放阅读框,编码一个由3 426个氨基酸组成的多聚蛋白。将试验测得株Du/CH/LSD/110128株与黄热病毒(Yellow fever virus)、登革热病毒(Dengue virus)、伊利乌斯脑炎病毒(Ilheus virus)、西尼罗病毒(West Nilevirus)、巴格扎病毒(Bagaza virus)和其他一些已公布序列的坦布苏病毒进行核酸同源性比较和遗传进化树分析,发现Du/CH/LSD/110128株与巴格扎病毒亲缘关系较近但介于病毒种的水平上,与其他株坦布苏病毒核酸同源性在87%以上,可以确定Du/CH/LSD/110128株属于新型鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus)。     

新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒和鸭坦布苏病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

[目的]建立能同时检测新型鸭呼肠孤病毒(New-type duck reovirus,NDRV)、新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)和鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)的方法.[方法]根据NDRV、NGPV和DTMUV基因组的保守区域设计3对特异性引物...     

江西部分地区种鸭坦布苏病毒病及鸭瘟免疫状况调查与分析

[目的]调查江西省部分地区规模化种鸭场鸭坦布苏病毒病和鸭瘟免疫状况.[方法]2020—2021年从江西省的11个规模化种鸭场采集血清样品1233份,应用酶联免疫吸附试验测定鸭坦布苏病毒病和鸭瘟的抗体水平.[结果]鸭坦布苏病毒病抗体的总阳性率为61.1％,阳性率最高的为E场(80.4％),11个种鸭场中有8个场的阳性率未达到国家合格率标准.鸭瘟抗体的总阳性率为80.5％,抗体阳性率较高的为I场(90.8％)和H场(88.8％),11个种鸭场中有2个场的鸭瘟抗体阳性率未达到国家合格率标准.不同季度调查结果显示第四季度鸭坦布苏病毒病和鸭瘟的抗体阳性率最高,第一季度的鸭坦布苏病毒病和鸭瘟抗体阳性率均未达到国家合格率标准.[结论]江西省部分地区规模化种鸭场的鸭坦布苏病毒病和鸭瘟免疫水平不容乐观.尤其是鸭坦布苏病毒病免疫水平较低,建议当地种鸭场加强鸭坦布苏病毒病和鸭瘟的免疫,定期监测抗体水平,优化免疫程序,以提高整个鸭群的保护力.     

鸭坦布苏病毒与新城疫混合感染的分离鉴定

鉴于上海某鸭场成年种鸭出现产蛋率下降、死亡率升高的现象,为有效解决此问题,通过鸭/鸡胚接种,进行了血凝及血凝抑制实验,对分离的病毒进行了鉴定,最终基本确诊为鸭新城疫和鸭坦布苏病毒混合感染,其发病原因是由于新城疫病毒引起鸭群抵抗力下降,导致并发坦布苏病毒感染。     

我国部分地区鸭1型甲肝病毒流行株遗传变异分析

为了解鸭群中鸭1型甲肝病毒(DHAV-1)的流行及其分子变异情况,对2015-2016年福建、广东、浙江及江西鸭群采集的327份临床样品进行检测、病毒分离鉴定、序列测定与分析。结果表明,自327份临床样品中检出DHAV-1阳性样品35份,阳性率10.7%;从阳性样品中分离获得23株DHAV-1,主要来自30日龄以内的麻鸭和半番鸭。对DHAV-1的VP1基因分子特征及遗传变异分析,表明23株病毒VP1基因核苷酸序列同源性介于93.3%~99.9%,分属2个病毒亚群,两亚群间的遗传距离为0.06。23株临床分离株中有18株与引起雏鸭胰腺泛黄的毒株(MPZJ1206株)处于同一亚群,为目前流行的优势毒株,与国内外疫苗株核苷酸同源性在91.3%~96.2%,存在较大差异。由此可见,我国福建省及周边地区鸭群中不同DHAV-1流行株之间及流行毒株与疫苗株间均存在不同程度的差异。     

鸭坦布苏病毒甲基转移酶的真核表达及鉴定

甲基转移酶(methyltransferase,MTase)是鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白5的重要功能基团,在病毒复制及致病过程中发挥重要作用.为了对鸭坦布苏病毒甲基转移酶进行真核表达,并对其生物学功能进行鉴定,以GenBank中收录的DTMUV JS804株基因序列为模板,设计针对MTase的特异性引物,提取TMUV RNA,反转录得到cDNA,以其为模板进行扩增,得到MTase的基因片段,然后亚克隆至pCMV-Flag真核表达载体中,构建重组质粒pCMV-Flag-MTase,提取去除内毒素的重组质粒,并转染至BHK-21细胞,通过间接免疫荧光观察和Western Blot鉴定该蛋白的表达.结果显示,质粒pCMV-Flag-MTase经双酶切鉴定证明构建正确,通过间接免疫荧光与Western Blot检测,重组质粒在BHK-21细胞内正常表达,表达的蛋白与天然坦布苏病毒MTase具有相同的反应原性.     

表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性

为开展鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联苗的研究,将密码子优化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因插入转移载体p EP-BGH-end构建了p EP-BGH-E重组表达质粒。在鸭瘟病毒疫苗株细菌人工染色体(p DEVvac)的基础上,首先通过Red E/T两步重组法构建了EF1启动子替换GFP基因CMV启动子的p DEV-EF1突变体克隆,并将p EP-BGH-E质粒上的重组表达框p CMV-E-BGH-p A再次通过两步重组克隆至p DEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带有外源基因DTMUV E的突变体克隆p DEV-E。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)获得了重组病毒r DEV-E。病毒蚀斑大小测定结果显示,r DEV-E在CEFs上的蚀斑面积较亲本株相比稍有减少。Western blotting分析表明,外源蛋白E在病毒感染的CEFs细胞中成功表达。     

一种引起种(蛋)鸭产蛋骤降新病毒的分离与初步鉴定

自表现产蛋骤降的病死种鸭中无菌采集卵巢以番鸭胚分离到病毒,经对分离的病毒(WR株)进行形态学观察、理化特性测定,发现该病毒有囊膜,直径为30～50nm;对氯仿处理敏感;在pH值为7.2条件下,不凝集鸡、鸭和鹅红细胞。人工感染开产麻鸭能复制出与自然感染病例相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒。应用RT PCR技术对分离毒进行检测,可扩增到约1kb特异性条带。经测序分析表明,所获得的核苷酸序列第9-777位与坦布苏病毒(TMUV)的同源性最高,为88.7%;遗传进化分析表明WR株病毒与坦布苏病毒、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、以色列火鸡脑膜炎病毒(ITV)、恩塔亚病毒(NTAV)具有相似的祖先,但在系统发生树上处于单独的进化分支。由此推测,WR株病毒不属于现有黄病毒科黄病毒属任何一种,为黄病毒属中的新成员,为国内外首次报道。     

抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)NS5蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的PET28a-NS5载体转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,利用纯化的鸭坦布苏病毒NS5蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗,并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得2株稳定分泌针对DTMUV的NS5蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为A4D1和B4B8。此2株杂交瘤细胞诱导BALB/c小鼠的抗体效价均可达到1∶64 000。间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,所获细胞分泌的抗体能与DTMUV及纯化的NS5蛋白发生特异性反应。经鉴定2株单抗的亚类均为IgG1型,通过叠加ELISA方法,初步判定2株单抗识别不同的抗原表位。【结论】成功获得了抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白的单克隆抗体,为研究NS5蛋白的功能奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒一步法RT-PCR检测方法的建立和应用

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是一种新发现可引起鸭产蛋下降的新型黄病毒,建立一种病原学检测方法对于疫病的诊断和流行病学研究具有重要意义。在对DTMUV序列的比对分析的基础上,设计了1对特异性引物,通过优化PCR反应条件,建立了DTMUV的一步法RT-PCR检测方法。该方法具有特异、快速、敏感、准确等特点,可以检出1.82个TCID50的病毒核酸。对2010年至2011年6月份前的106份产蛋下降鸭群临床病料进行了检测,结果显示样品阳性率为46.2%,表明DTMUV在浙江及其周边省份的产蛋鸭群具有较高的感染率。     

鸭坦布苏病毒病、鸭圆环病毒病与鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断

为确诊贵州省三穗县某鸭场62日龄花边鸭发病原因,通过临床症状观察及对采集的10只病鸭进行病理剖检、细菌分离鉴定、病毒PCR/RT-PCR检测。结果表明：分离到4株鸭疫里默氏杆菌,对头孢类药物高度敏感,对大环内酯类和氨基糖苷类药物耐药;通过病毒特异性引物扩增出鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒条带。该鸭场病鸭由鸭坦布苏病毒、鸭圆环病毒和鸭疫里默氏杆菌混合感染所致。     

鸽源鸭甲肝病毒1型的分离与鉴定

为对1株鸽源鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)进行分离与鉴定,通过细菌分离排除法和病毒分离方法获得致鸭胚死亡病毒(暂命名为FJ-12-20株)。该病毒无血凝活性,可被DHAV-1引物所扩增,但不能被鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鹅细小病毒特异引物所扩增,病毒液攻击樱桃谷鸭和番鸭可引起死亡,并出现了典型的鸭肝炎病变,重新分离获得病毒株。将DHAV-1特异性扩增产物回收后克隆,序列分析表明FJ-12-20株与参考株DHAV-1的同源率为93.5%～99%,与DHAV-2和DHAV-3参考株的同源率均为78.4%。遗传进化分析表明FJ-12-20株与DHAV-1关系密切,它们在进化树中共处一分支。     

鸭坦布苏病毒病、鸭圆环病毒病与鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断

为确诊贵州省三穗县某鸭场62日龄花边鸭发病原因,通过临床症状观察及对采集的10只病鸭进行病理剖检、细菌分离鉴定和病毒PCR/RT-PCR检测。结果表明:分离到4株鸭疫里默氏杆菌,对头孢类药物高度敏感,对大环内酯类和氨基糖苷类药物耐药;病毒特异性引物扩增出鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒条带。该鸭场病鸭由鸭坦布苏病毒、鸭圆环病毒和鸭疫里默氏杆菌混合感染所致。