山羊重组IL-17A克隆表达与生物活性分析

为了分析山羊白介素17A(IL-17A)对山羊单核、中性粒细胞功能的影响,采用RT-PCR方法对山羊IL-17A基因进行克隆,并在体外表达得到重组蛋白质(rIL-17A),以不同质量浓度的重组蛋白rIL-17A(5、10、20、40μg/mL)与单核细胞和中性粒细胞共孵育,测定rIL-17A对山羊单核细胞和中性粒细胞的迁移、中性粒细胞凋亡的免疫调节效应。结果显示:5、20、40μg/mL的rIL-17A能够极显著促进山羊单核细胞的迁移(P0.01),10μg/mL的rIL-17A也能显著促进山羊单核细胞的迁移(P0.05);与中性粒细胞共孵育时,10μg/mL(P0.05)和20、40μg/mL(P0.001)的rIL-17A能显著或极显著促进山羊中性粒细胞的迁移;20μg/mL(P0.05)、40μg/mL(P0.001)的rIL-17A能显著或极显著诱导山羊中性粒细胞的凋亡。结果表明:重组蛋白rIL-17A具有良好的生物学活性,能在体外不同程度地促进山羊单核细胞、中性粒细胞的迁移及中性粒细胞的凋亡。     

浅谈人畜共患寄生虫病

人畜共患寄生虫病的种类繁多，不仅对畜牧业造成巨大经济损失，而且严重威胁人类健康。本文主要介绍了血吸虫病、猪囊虫病、旋毛虫病、弓形虫病、隐孢子虫病、住肉孢子虫病等人畜共患寄生虫病的的致病性及其流行因素。希望能提高人们对人兽共患寄生虫病的认识，并能积极主动预防和控制人兽共患寄生虫病的发生。     

巨型艾美耳球虫偏菱形样蛋白EmRP免疫原性分析

在前期研究中,从巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)cDNA文库中筛选到了免疫保护性抗原偏菱形样蛋白EmRP,本研究为揭示该抗原的免疫保护机理,进一步检测了其免疫原性。以E.maxima卵囊cDNA为模板,用RT-PCR技术扩增EmRP,并构建真核表达质粒pVAX1-EmRP,将其经腿部肌肉注射2周龄的雏鸡,3周龄加强免疫。分别于首次免疫后和加强免疫后1周,采集血清,用ELISA方法检测血清特异性IgG水平,用荧光定量PCR方法(qPCR)检测细胞因子水平,用流式细胞术检测CD4^+T淋巴细胞和CD8^+T淋巴细胞的比例,分析EmRP诱导的免疫反应。序列分析表明,EmRP含有偏菱形样蛋白超家族成员保守区域,为非跨膜蛋白,分子量约为28.4 kD。真核表达质粒pVAX1-EmRP免疫鸡后,与对照组相比,鸡体IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17等细胞因子转录水平显著提升;CD8^+和CD4^+ T细胞比例显著提高,而血清特异性IgG水平与对照组差异不显著。结果表明,EmRP诱导的免疫保护作用主要是由其诱导的细胞免疫反应实现的,可以作为研制E.maxima新型疫苗的候选抗原。     

捻转血矛线虫脂肪酶基因表达与生物学特性分析

选取捻转血矛线虫脂肪酶(Lipase)进行基因克隆、表达并对其生物学特性进行探究。PCR克隆捻转血矛线虫lipase基因,构建表达载体,获得融合蛋白质,采用Western blot检测该蛋白质的抗原特性;酯类酶解反应检测该融合蛋白质脂肪酶活性;实时定量PCR检测该基因在捻转血矛线虫不同发育阶段的转录情况;间接免疫荧光试验检验该抗原蛋白质在虫体组织的定位情况。结果表明,去除lipase基因信号肽序列后,基因片段长864bp,融合蛋白质大小50ku;该融合蛋白质在37℃左右、pH为7的条件下酶活力最高;雄性成虫lipase转录量相对虫体其他阶段最高;该抗原蛋白质主要表达于虫体表皮和肠腔。Lipase具有较好的抗原性,可能与捻转血矛线虫发育和宿主免疫调节有关,深入研究捻转血矛线虫Lipase的特性对寻找新的免疫保护性抗原和药物靶标具有意义。     

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。     

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)氨基肽酶基因克隆、表达及重组蛋白活性分析

通过RT—PCR扩增出捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）氨基肽酶基因，并对该基因进行克隆、鉴定及序列测定。捻转血矛线虫氨基肽酶ORF由2919个碱基（972个氨基酸）构成，和GenBank中的捻转血矛线虫氨基肤酶（H11抗原）同源性高达98％。与秀丽新杆线虫（Caenorhabditis elegans）肽酶M1家族同源性为61％，且具有氨基肽酶特征性基序HEXXH和GAMEN。将该基因亚克隆到原核表达栽体并进行了表达，通过测定重组蛋白分解氨基肽酶底物的能力以及对酶抑制荆敏感性试验，进一步证实了H11抗原具有一定的酶活性。     

传染性法氏囊病毒分子生物学研究进展

传染性法氏囊病病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ　,　ＩＢＤＶ）是鸡的重要传染病病原之一,除了直接引起３周龄～６周龄易感鸡发病死亡外,更为重要的是破坏机体的免疫器官,引起免疫抑制,导致鸡群丧失对其它病原的免疫力,给世界养鸡业造成巨大的经济损失。本文主要从病毒的特性、基因组结构和病毒蛋白及变异几方面对ＩＢＤＶ研究进展进行浅述。１主要特性１.１分类由于ＩＢＤＶ在鸡胚肾细胞上培养出现的细胞病变、对某些理化因素的抵抗力及电镜下形态同呼肠孤病毒（ＲＨ）Ｖ相似,所以一开始被误…     

捻转血矛线虫H11基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将捻转血矛线虫H11基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后,用氯化锂法转化巴斯德毕赤酵母菌株X-33,通过含ZeocineTM抗生素的YPD平板筛选出72个重组子.重组酵母用甲醇诱导后,经RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明捻转血矛线虫H11在巴斯德毕赤酵母中实现了表达.     

山羊IL-9基因克隆表达与单克隆抗体的制备

为了研究捻转血矛线虫诱导山羊产生Th9型免疫应答的特点,制备了抗山羊IL-9单克隆抗体。采用基因克隆、表达和纯化得到重组蛋白IL-9,并以重组IL-9为免疫原,重组蛋白IL-9和His-tag为筛选抗原,通过杂交瘤细胞技术,筛出1株稳定分泌抗山羊IL-9单克隆抗体细胞株,命名为6A11A8。将该细胞株接种小鼠腹腔,制备腹水,并将纯化后的抗体与生物素耦合,用流式细胞术检测山羊外周血单核细胞(PBMCs)中表达IL-9的细胞亚类。结果显示:融合蛋白大小约为16 ku,主要分布于包涵体中,筛选出的6A11A8细胞株产生的抗体效价高、特异性强,其细胞上清抗体效价可达1∶2430,其抗体亚型为IgG2bκ,层析柱纯化小鼠腹水后其效价可达1∶512 000,该单抗可识别山羊PBMCs中分泌IL-9的亚类细胞。结论:本研究获得了山羊IL-9单克隆抗体,为研究山羊Th9型免疫反应奠定了基础。     

旋毛虫重组二肽基肽酶1在体外对大鼠外周血单个核细胞增殖、吞噬、凋亡等的影响

本文旨在分析旋毛虫二肽基肽酶1（dipeptidyl-peptidase 1，Dpp1）在体外对大鼠外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）增殖、迁移、凋亡以及一氧化氮（NO）分泌和吞噬功能的影响。根据GenBank中旋毛虫Dpp1基因序列设计一对特异性引物，RT-PCR获得该基因，将其亚克隆到pET-32a原核表达载体，IPTG诱导后获得重组蛋白rDpp1。将大鼠PBMCs与rDpp1共孵育，用间接免疫荧光试验（IFA）分析rDpp1与大鼠PBMCs的结合情况，分析不同质量浓度（10、20、40 μg·mL^-1）的rDpp1对细胞增殖、迁移、NO分泌、吞噬功能和细胞凋亡的影响。结果表明，40 μg·mL^-1rDpp1极显著促进PBMCs增殖；10 μg·mL^-1rDpp1能显著促进PBMCs迁移，而20及40 μg·mL^-1时表现极显著的促进；20与40 μg·mL^-1rDpp1极显著促进PBMCs分泌NO；10 μg·mL^-1rDpp1能显著促进PBMCs的吞噬功能，而20及40 μg·mL^-1时表现极显著的促进；各质量浓度蛋白均极显著地促进PBMCs的凋亡。旋毛虫二肽基肽酶1在体外能通过多种途径影响大鼠外周血单个核细胞，对调节宿主免疫应答有一定的促进作用。