捻转血矛线虫Hc-TTR-51蛋白的定位及功能

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是最重要的家畜寄生虫之一。已报道秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)参与虫体细胞间的相互作用。目前捻转血矛线虫转甲状腺素蛋白(Hc-TTR-51)的定位及功能尚未见报道。研究首先克隆捻转血矛线虫Hc-ttr-51基因,然后分析其蛋白在捻转血矛线虫、HEK 293T细胞内的定位情况,最后RNA干扰Hc-ttr-51基因分析对秀丽隐杆线虫生长发育的影响,从而对其功能进行预测分析。结果表明,捻转血矛线虫Hc-ttr-51基因在虫体各发育阶段均有表达,与其他发育期虫体相比,L1、L3、雄成虫该基因的转录水平显著上升。在L3期虫体体内该蛋白广泛表达,L4期和成虫体内该蛋白特异性表达于性腺。在HEK 293T细胞中,该蛋白在细胞质中呈明显的点状分布。RNA干扰秀丽隐杆线虫Hc-ttr-51基因表达后,虫体产卵量极显著下降,体长体宽显著缩短,咽泵率显著下降。以上研究为捻转血矛线虫生长发育特性、疫苗研究等提供依据。     

捻转血矛线虫感染性三期幼虫gst基因的筛选及抗干燥功能分析

为研究干燥作用对捻转血矛线虫L3期幼虫mRNA表达的影响,筛选并分析干燥相关表达基因,本试验利用mRNA差异显示技术得到了捻转血矛线虫干燥相关基因,通过相对荧光定量PCR验证所获基因的表达情况,并在秀丽隐杆线虫中通过RNA干扰抑制相关同源基因的表达检测干燥后复苏虫体生存率以研究基因抗干燥功能。结果显示,差异表达序列GH-U02A与已知捻转血矛线虫谷胱甘肽-S-转移酶(GST)氨基酸同源性为94%。对秀丽隐杆线虫Ce-gst-7基因进行RNA干扰后,虫体在干燥后的生存率降低,证明gst基因在线虫中有抗干燥功能。     

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)氨基肽酶基因克隆、表达及重组蛋白活性分析

通过RT—PCR扩增出捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）氨基肽酶基因，并对该基因进行克隆、鉴定及序列测定。捻转血矛线虫氨基肽酶ORF由2919个碱基（972个氨基酸）构成，和GenBank中的捻转血矛线虫氨基肤酶（H11抗原）同源性高达98％。与秀丽新杆线虫（Caenorhabditis elegans）肽酶M1家族同源性为61％，且具有氨基肽酶特征性基序HEXXH和GAMEN。将该基因亚克隆到原核表达栽体并进行了表达，通过测定重组蛋白分解氨基肽酶底物的能力以及对酶抑制荆敏感性试验，进一步证实了H11抗原具有一定的酶活性。     

利用mRNA差异显示技术克隆分析捻转血矛线虫滞育相关基因

以培养获得的捻转血矛线虫滞育期虫体及同期正常发育的虫体为研究材料,采用设计的锚定引物和随机引物,通过mRNA差异显示PCR技术对滞育期幼虫的差异表达基因进行了筛选。结果获得了74个滞育期差异表达的基因EST。生物信息学分析表明：29个差异序列与已知的捻转血矛线虫基因组序列具有同源性;14个差异序列与已知线虫的EST具有同源性。同源基因中的rps-30、T24F1.2等已被证明参与了秀丽隐杆线虫的滞育形成。差异序列的克隆为捻转血矛线虫滞育相关基因及滞育形成机制的研究奠定了基础。     

捻转血矛线虫ES24抗原基因的克隆与表达特性分析

根据捻转血矛线虫ES24抗原基因序列(U64793.1)设计1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出大小约为670 bp的DNA片段。将该DNA片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果发现该基因与GenBank中已知的捻转血矛线虫24 ku ES抗原基因的相似性达96%～98%。将该基因的开放阅读框插入pET28a(+)载体中,获得原核表达质粒pET28/ES24,并转化大肠杆菌BL21。重组细菌用IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,结果表明该基因获得了表达,重组蛋白分子量大小约为25 ku。用实时荧光定量PCR技术对该基因在捻转血矛线虫的虫卵、第3期幼虫、雌虫和雄虫等不同发育阶段、不同性别虫体内的表达情况进行了定量分析,结果显示ES24基因在雄性成虫中表达量最高,雌虫和虫卵其次,在第3期幼虫中表达最低。     

捻转血矛线虫ZJ株24000分泌排泄(ES)蛋白基因的克隆和序列分析

通过 RT- PCR方法 ,从捻转血矛线虫成虫总 RNA中扩增得到特异性片段 ,并把这一基因片段克隆到 p U C18克隆载体上 ,进行测序及同源性比较。序列分析可知 ,其核苷酸序列与国外已发表的 2 4 0 0 0分泌排泄抗原基因的同源性为 99.2 %。表明本试验成功提取了捻转血矛线虫成虫总 RNA,并用 RT- PCR方法克隆了 2 4 0 0 0分泌排泄抗原基因 ,为该基因的表达及其免疫学作用研究奠定了基础     

捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域所在片段的克隆及原核表达

参照捻转血矛线虫Hc38基因核酸序列(登录号:AY749124)的保守结构域设计1对引物,采用RT-PCR方法从绵羊捻转血矛线虫雌性成虫中扩增出约429 bp的cDNA序列,将其克隆到pMD19-T中,经酶切鉴定证实,并进行序列测定.与AY749124序列同源性为99%.进一步将克隆基因与原核表达载体pPRO EX HTa构建重组表达载体,经IPTG诱导,能在DH5a细菌中表达了相对分子质量约17 000的融合蛋白.经Western blot等检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与捻转血矛线虫阳性血清发生特异性反应.     

捻转血矛线虫阿苯达唑耐药株给药前后比较转录组学分析

为探明捻转血矛线虫阿苯达唑耐药株给药前后在转录组水平上的差异,本研究采用Illumina Hiseq4000对给药前后的捻转血矛线虫进行转录组测序,筛选得到差异表达基因并通过GO和KEGG数据库对其进行功能注释及富集性分析,并利用荧光定量PCR验证部分差异表达基因。结果显示,共筛选获得851个显著差异表达基因,其中包括584个上调基因和267个下调基因。通过GO功能富集分析显示,有458、418和367个基因分别注释到生物学过程、分子功能和细胞组分三大类;对差异表达基因进行KEGG富集分析显示,有173个差异表达基因参与到75条KEGG通路中,显著富集在核糖体合成、细胞凋亡、过氧化物酶增殖体激活受体(PPAR)等信号通路。本试验初步筛选了阿苯达唑耐药株给药前后的差异表达基因,为深入探索捻转血矛线虫耐药性分子机制、筛选对耐药性检测的分子标记及耐药性早期鉴别诊断方法的建立提供重要数据。     

西藏牦牛捻转血矛线虫的鉴别

捻转血矛线虫属毛圆科血矛属线虫,是危害反刍动物最严重的消化道寄生虫之一,常引起反刍动物的贫血、生产繁殖性能及抗病力下降,给畜牧业带来较大的经济损失。本文报道了西藏林芝地区某农牧户被宰牦牛真胃线虫的分离鉴别,经对虫体形态观察和PCR检测,确认为捻转血矛线虫。     

猪三类线虫病的分析、诊断和治疗

猪的三种线虫病,即猪捻转血矛线虫病、猪类圆线虫病和猪鞭虫病。常见的猪捻转血矛线虫有3种,即细小捻转血矛线虫、圆形螺咽线虫和六翼泡首线虫;猪类圆线虫病主要是指兰氏类圆线虫;猪鞭形线虫简称猪鞭虫。本文主要从虫体、临床表现、诊断和治疗等方面猪三类线虫病进行了阐述。1猪捻转血矛线虫病1.1虫体常见于猪的捻转血矛线虫有3种:一种是细小捻转血矛线虫,又称红色猪圆线虫;另外2种粗大捻转血矛线虫是圆形螺咽线虫和六翼泡首线虫。     

捻转血矛线虫HSP60原核表达及特性分析

根据Gen Bank公布的捻转血矛线虫热休克蛋白60(HSP60)基因序列,设计一对特异性引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,通过RTPCR技术扩增出一条约为1 700 bp的DNA片段,将该片段克隆到p MD19-T载体上进行序列分析,结果显示该片段长1 710 bp,编码569个氨基酸。将该基因片段亚克隆到p ET32a(+)载体上,转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE显示,该基因成功表达,其融合蛋白分子量为80.7 ku,主要分布于菌体上清中。Western blot结果显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊血清所识别。Real-time PCR分析显示,HSP60基因在第三期幼虫和活化第三期幼虫中的相对表达量分别为1.0和0.88。本文探讨捻转血矛线虫HSP60功能奠定了基础。     

山羊源3种不同形态阴门盖捻转血矛线虫雌虫的多位点序列分析

旨在解析3种不同形态阴门盖捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）的遗传进化差异，本研究从养殖场山羊皱胃中分离到捻转血矛线虫虫体，采用普通光学显微镜观察71条雌虫虫体阴门盖的形态结构特征，并基于捻转血矛线虫ITS-1、ITS-2和nad4基因位点，采用PCR法对不同阴门盖的虫体进行扩增，通过比对多位点序列进行遗传进化分析。经显微镜观察发现，本研究分离到的捻转血矛线虫雌虫阴门盖存在舌瓣形、亚球形和舌-球混合形3种形态，所占比例分别为45.07%（32/71）、50.70%（36/71）和4.23%（3/71）。对43条雌虫全长和阴门至虫体末端长度进行测量和统计分析，结果显示，3种不同形态阴门盖的捻转血矛线虫全长统计学差异不显著（P>0.05），而3种不同形态阴门盖的捻转血矛线虫阴门至虫体末端的长度存在显著性差异（P<0.05）。基于捻转血矛线虫ITS-1、ITS-2和nad4基因进行的序列分析结果显示，不同形态阴门盖虫体的9个样品在3个基因位点上存在不同程度的碱基差异，多态性位点分别为10、13和43个，核苷酸多态性分别为0.85%、1.34%和1.97%。基于ITS-1和ITS-2构建的遗传进化树显示，研究中所用样品与GenBank上H.contortus的参考序列处于同一进化支，表明本研究所分离到的虫体均属捻转血矛线虫。捻转血矛线虫雌虫的阴门盖存在形态学差异，不同形态阴门盖虫体在ITS-1、ITS-2和nad4基因位点上均存在不同程度的碱基差异，此研究结果为捻转血矛线虫的种类鉴定和遗传进化提供了参考数据。     

新疆伊犁地区捻转血矛线虫种群Ⅰ型β微管蛋白基因苯并咪唑抗药性相关单核苷酸多态性调查

为了了解新疆伊犁地区捻转血矛线虫对苯并咪唑类药物的抗药性情况,本课题组对该地区某绵羊场捻转血矛线虫种群Ⅰ型β微管蛋白基因苯并咪唑抗药性相关单核苷酸多态性进行了调查。在通过捻转血矛线虫ITS-2种特异性PCR鉴定为捻转血矛线虫的基础上,分别扩增了27条捻转血矛线虫雄虫的Ⅰ型β微管蛋白基因,测序后对抗药性相关的167,198位点和200位点的单核苷酸多态性进行了调查研究。结果表明,该羊场的捻转血矛线虫种群的抗药性突变只发生在198位点和200位点,以198位点的抗药性突变为主,没有在167位点发现抗药性突变。共发现了4种基因型,198纯合敏感型及200位点纯合敏感型(20; 74. 07%)、198杂合抗药型及200位点纯合敏感型(3; 11. 11%)、198纯合敏感型及200位点杂合抗药型(2; 7. 41%)和198纯合抗药型及200位点纯合敏感型(2; 7. 41%)。该羊场捻转血矛线虫种群中存在198位点的纯合抗药型突变,说明有抗药性的风险,需要引起注意。本研究首次从分子水平报道了新疆伊犁地区捻转血矛线虫种群Ⅰ型β微管蛋白基因存在苯并咪唑抗药性突变,这对该地区以及其他类似地区的捻转血矛线虫病的防控以及抗药性的管理具有一定的指导意义。     

山羊捻转血矛线虫ITS基因序列分析

为了解不同年份山羊源捻转血矛线虫内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)基因的遗传变异情况,提取2015年-2020年间陕西省咸阳地区44株山羊源捻转血矛线虫的核糖体DNA(rDNA),对其ITS基因进行扩增、测序与分析.结果显示,44株捻转血矛线虫的ITS-1序列长度为400 b...     

捻转血矛线虫Hc38保守结构域所在基因片段的真核表达载体构建

根据捻转血矛线虫Hc38基因产物(登录号AY749124)保守结构域所在核酸序列设计1对引物,该引物包含Kozak序列、HindⅢ酶切位点、Xba Ⅰ酶切位点.以含有捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域片段的pMD19-T为模板,经PCR扩增获得Hc38基因保守结构域片段,用HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切该片段,回收后将此基因片段克隆至相同酶切回收后的真核表达载体pcDNA3.1(+)中,获得重组质粒pcD-NA3.1-Hc38.经酶切分析、序列测定和PCR鉴定,证实了重组质粒的正确性.     

耐伊维菌素捻转血矛线虫谷氨酸门控氯离子通道gbr-2基因分析

为了解谷氨酸门控氯离子通道(Glucl)gbr-2基因在捻转血矛线虫抗伊维菌素虫株是否存在突变,以及变异情况如何,本试验以捻转血矛线虫耐伊维菌素虫株作研究对象,提取基因组DNA后以特异性引物扩增gbr-2基因,并对扩增产物进行测序和分析。同时以敏感株虫体作对照。试验结果表明,与对照组相比,耐药株的基因序列发生了突变,在80~170 bp处出现多处突变;在192~207 bp处的碱基发生丢失。两者同源性为88.9%。试验结果说明,捻转血矛线虫抗伊维菌素虫株的谷氨酸门控氯离子通道gbr-2基因确实存在突变,为进一步了解捻转血矛线虫抗伊维菌素虫株的耐药性分子机制,以及筛选耐药性检测的分子标记,建立耐药性的早期检测手段提供重要数据。     

基于ITS序列的捻转血矛线虫系统进化分析

为分析捻转血矛线虫ITS序列的变异与虫株特性之间的关系,对捻转血矛线虫不同药物抗性虫株(苯并咪唑类药物抗性虫株、伊维菌素抗性虫株、莫西菌素抗性虫株、药物敏感虫株)、不同宿主来源虫株(长颈鹿、牛、绵羊、山羊、牦牛)和不同地理位置(中国、美国、意大利、法国、也门、马来西亚、澳大利亚)的分离株,以及毛圆科的其他线虫的ITS序列进行了分析。结果发现捻转血矛线虫与毛圆科其他线虫的ITS-2基因的相似性高,基于该基因建立的系统进化树可以很好地区分毛圆科不同属的线虫;捻转血矛线虫的抗药性特点与其ITS-1基因的变异进化关系不大;不同地理位置的捻转血矛线虫分离株的ITS-2基因变异很小;从野生动物长颈鹿体内分离的捻转血矛线虫的ITS-1基因与家养反刍动物分离株的差异较明显。研究结果表明捻转血矛线虫ITS序列在种内相对保守,不同虫株间变异较小,在毛圆科线虫的分子分类中具有一定意义。     

新疆部分地区羊捻转血矛线虫系统进化与抗药性分析

为了解新疆塔城及博乐地区羊捻转血矛线虫的流行情况和系统进化关系,以及这两个地区捻转血矛线虫对苯并咪唑类药物的抗药性,在塔城和博乐地区分别收集20、12个羊皱胃分离捻转血矛线虫,进行形态学鉴定、分子生物学鉴定以及抗药性分析。结果显示:在塔城地区的14个羊皱胃内发现有寄生性线虫,通过PCR鉴定出27只捻转血矛线虫;在博乐地区的7个羊皱胃内发现有寄生性线虫,共鉴定出55只捻转血矛线虫。对PCR阳性样品进行测序并应用最大似然法构建系统发育树进行系统进化分析发现:本试验所测序列与GenBank上的捻转血矛线虫虫株序列聚为一支,置信度为100%;与捻转血矛线虫同科不同属的环纹背带线虫虫株序列相聚类,置信度为100%;其外群为不同科、不同属的羊仰口线虫,登录号为KP792295.1;内群与外群分别形成独立的进化分支。对β-tubulin基因进行多序列比对发现,所选样本并未出现苯并咪唑类药物抗性。本研究有助于了解捻转血矛线虫流行情况,并为捻转血矛线虫系统进化及苯并咪唑类药物抗性分析提供了依据。     

基于SSR的羊捻转血矛线虫病的分子鉴定及PCR检测方法的建立

为能快速灵敏的检测羊捻转血矛线虫病,试验采用微卫星DNA分子标记对羊捻转血矛线虫进行二重PCR扩增。对反应条件和体系的优化,筛选出2组可用以鉴定羊捻转血矛线虫的微卫星DNA组合。结果表明:PCR条带清晰、与预期片段大小吻合。试验建立了快速准确识别羊捻转血矛线虫的分子鉴定方法,为羊捻转血矛线虫病的快速检测和诊断提供依据。     

利用mRNA差异显示技术分离捻转血矛线虫感染性三期幼虫抗干燥相关基因

捻转血矛线虫感染性三期幼虫对干燥环境具有很强的抵抗力,环境适宜时可恢复到正常状态并继续感染宿主.为初步探讨捻转血矛线虫感染性三期幼虫抗干燥的分子机制,试验对该期幼虫施以不同干燥条件的处理,筛选出虫体存活率达到90％的干燥条件.在筛选到的条件下(相对湿度为50％,时间为60 h)处理虫体,采用mRNA差异显示技术分析干燥环境下培养的虫体和正常虫体的mRNA表达差异.经验证获得了48个差异表达的EST序列,其中25个(52.08％)序列与现有捻转血矛线虫基因组数据库有高度同源性；15个(31.25％)序列与已知线虫的cDNA序列或基因组序列有较高同源性；9个(18.75％)序列与其他线虫已知蛋白质氨基酸序列同源性较高.差异表达序列AF-U01C与多种线虫的蛋白酶体β亚基家族成员同源性达90％,差异表达序列AG-U01A与多种线虫的β酮脂酰CoA硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)同源性达65％.结果为进一步研究寄生性线虫抗干燥机制奠定基础.