捻转血矛线虫感染性三期幼虫gst基因的筛选及抗干燥功能分析

为研究干燥作用对捻转血矛线虫L3期幼虫mRNA表达的影响,筛选并分析干燥相关表达基因,本试验利用mRNA差异显示技术得到了捻转血矛线虫干燥相关基因,通过相对荧光定量PCR验证所获基因的表达情况,并在秀丽隐杆线虫中通过RNA干扰抑制相关同源基因的表达检测干燥后复苏虫体生存率以研究基因抗干燥功能。结果显示,差异表达序列GH-U02A与已知捻转血矛线虫谷胱甘肽-S-转移酶(GST)氨基酸同源性为94%。对秀丽隐杆线虫Ce-gst-7基因进行RNA干扰后,虫体在干燥后的生存率降低,证明gst基因在线虫中有抗干燥功能。     

鸦胆子对鸡球虫卵囊孢子化率及子孢子的直接杀伤作用

自苦木科植物鸦胆子中提取了鸦胆子油(BJ-PE)、鸦胆子乙醇萃取物(BJ-EE)和鸦胆子水提物(BJ-WE),通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)检测了鸦胆子油的化学成分,并探讨了鸦胆子提取物对鸡球虫卵囊孢子化的影响及对子孢子的直接杀伤作用。结果显示,通过GC-MS法鉴定出鸦胆子油中含有32种化合物,主要为脂肪酸、脂肪醇类化合物及少量芳香族化合物。鸡球虫卵囊经BJ-EE、BJ-WE和Bruceine-D处理后,未孢子化率升高,其中8g/L BJ-WE处理组中未孢子化卵囊的数量显著高于对照组(P0.05)。子孢子经BJ-EE和Bruceine-D处理后,数量显著减少,形态发生明显变化,表现出变短、变圆的趋势。透射电镜观察发现,子孢子或萎缩成小球,外膜轮廓模糊,淀粉粒减少;或细胞膜破裂,胞内细胞器排列混乱;或呈现哑铃型,结构扭曲。综上所述,鸦胆子提取物对鸡球虫卵囊的孢子化具有一定的抑制作用,对子孢子具有较强的直接杀伤作用,为抗球虫药物的研发提供了新选择。     

捻转血矛线虫Hc-FAR-4蛋白的表达特性及其与配体结合能力分析

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)寄生在牛羊等反刍动物的皱胃中,引起的捻转血矛线虫病在我国呈全国性流行。文章通过研究脂肪酸与视黄醇结合相关蛋白Hc-FAR-4的表达特性及配体结合能力,以了解其在捻转血矛线虫生长、发育、繁殖过程中的作用。【方法】对Hc-far-4进行克隆、并且构建原核表达载体pET-30a-Hc-far-4,pET-30a-Hc-far-4重组质粒经过PCR与双酶切鉴定准确无误之后转化到E. coli BL21感受态细胞中,用0.1 mmol·L ^-1IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)进行重组蛋白的诱导表达。收集重组蛋白rHc-FAR-4,利用荧光分析法,研究rHc-FAR-4蛋白与DAUDA、视黄醇、油酸的结合能力。配体结合试验是依据荧光物质retinol与脂肪酸类似物DAUDA在极性和非极性溶液中,在某一波长的激发光激发下,所发出的荧光光谱随之变化的特性,判断rHc-FAR-4蛋白是否具有与DAUDA、retinol结合的能力。再在体系中加入非荧光长链脂肪酸油酸,根据荧光光谱的变化情况判定油酸能否分别与DAUDA、retinol竞争目的蛋白的脂肪酸结合位点,间接说明目的蛋白能否与非荧光脂肪酸油酸结合。同时制备鼠源多克隆抗体,利用ELISA技术检验免疫后小鼠的抗体效价,抗体效价合适即可收集小鼠血清。收集的血清用于免疫组织荧光（IHF）试验,探究Hc-FAR-4的表达部位,从而推测其功能。该试验过程为：对捻转血矛线虫进行石蜡包埋,石蜡切片,抗原修复,3%的BSA 于4℃封闭过夜,自制鼠源多克隆抗体作为一抗孵育1 h; Alexa Fluor? 488 nm羊抗鼠IgG作为二抗避光孵育1 h,DAPI染色30 min,激光共聚焦显微镜检查染色情况。利用荧光定量PCR技术分析Hc-far-4在捻转血矛线虫各个主要阶段的表达特性。【结果】成功克隆目的基因Hc-far-4,测序结果与Sanger数据库中捻转血矛线虫far-4基因序列（>HCISE00908800.t1）相似度为 99.9%;重组质粒 pET-30a-Hc-far-4在E. coli BL21中成功表达,在诱导8 h后达到峰值。经过ELISA检测,结果显示制备的鼠源多克隆抗体效价达到1﹕1 024 000—1﹕2 048 000,可用于后续试验。Western Blot鉴定结果显示rHc-FAR-4重组蛋白带有His标签,并且条带大小为25 kD,结果符合预期。制备的鼠源多克隆抗体经过Western Blot鉴定,能够与天然Hc-FAR-4 蛋白结合,说明该抗体可用于IHF试验。配体结合试验结果表明 rHc-FAR-4蛋白具有结合脂肪酸与视黄醇的能力。荧光定量PCR分析表明,Hc-far-4在四期幼虫中的转录水平最高;IHF试验表明,Hc-FAR-4主要表达在捻转血矛线虫的肠壁、性腺中。综上推测Hc-FAR-4蛋白主要在寄生生活阶段参与了转运脂肪酸与视黄醇,为捻转血矛线虫的生长发育与生殖提供营养物质。【结论】捻转血矛线虫 FAR-4 蛋白能够结合脂肪酸类似物DAUDA和视黄醇,但是与油酸的结合能力较弱,主要表达在肠壁,在性腺、角皮中也有少量表达,其基因在进行营寄生生活阶段时表达量达到峰值。     

利用mRNA差异显示技术克隆分析捻转血矛线虫滞育相关基因

以培养获得的捻转血矛线虫滞育期虫体及同期正常发育的虫体为研究材料,采用设计的锚定引物和随机引物,通过mRNA差异显示PCR技术对滞育期幼虫的差异表达基因进行了筛选。结果获得了74个滞育期差异表达的基因EST。生物信息学分析表明：29个差异序列与已知的捻转血矛线虫基因组序列具有同源性;14个差异序列与已知线虫的EST具有同源性。同源基因中的rps-30、T24F1.2等已被证明参与了秀丽隐杆线虫的滞育形成。差异序列的克隆为捻转血矛线虫滞育相关基因及滞育形成机制的研究奠定了基础。     

贝氏隐孢子虫Rhomboid基因的克隆与生物信息学分析

将Gen Bank中发表的C.parvum、C.hominis和C.muris的菱形体蛋白(Rhomboid,ROM)基因序列进行比对分析,设计合成该基因保守片段的1对特异性引物,以贝氏隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增出CbROM基因保守片段,采用染色体步移技术获得基因片段3'端和5'端核苷酸序列,并对所得序列进行测序、拼接与生物信息学分析。结果显示,CbROM基因ORF长度为1 422 bp,编码473个氨基酸,蛋白质理论相对分子质量为52 700,等电点为8.65,是疏水性蛋白质,含有7个串连的跨膜螺旋区,无信号肽;该基因含有典型的菱形体蛋白相关保守结构域,属于菱形体蛋白酶家族;功能位点分析结果显示,CbROM蛋白序列包含6个N-糖基化位点,2个c AMP、c GMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,8个蛋白激酶C磷酸化位点,7个酪蛋白激酶II磷酸化位点和10个N-豆蔻酰化位点;二级结构中包含α-螺旋38.27%,β-折叠16.7%和无规则卷曲45.03%。本试验获得的贝氏隐孢子虫的Rhomboid基因序列,为该基因功能的进一步研究及其基因工程疫苗的研制奠定基础。     

国内羊胃肠道寄生虫流行病学调查及捻转血矛线虫系统进化分析

为更好地掌握我国部分地区羊胃肠道寄生虫病的流行情况以及捻转血矛线虫ZJ株近年来的系统进化关系,从而为捻转血矛线虫病的防治提供科学依据,于2014年9—12月采集了来自山东、吉林、黑龙江、内蒙古、辽宁、河北、江苏、天津和青海9个省(市)的490份羊粪样品,对其进行了寄生虫虫卵分类鉴定,对羊寄生虫病的流行病学特征进行总结分析;此外实验室于2004—2013年采集了来自浙江省嘉兴地区的15份捻转血矛线虫ZJ株成虫样品,设计特异性引物对样品ITS-2和ND4基因进行分子克隆测序鉴定比对,对该虫近10年来的系统进化进行分析。结果表明,全国各地羊体内肠道寄生虫的感染情况均较为严重,其中感染虫种的严重程度依次为原虫(83.27%)、线虫(64.29%)和绦虫(49.80%),感染相对最为严重的3个地区分别为天津、青海和内蒙古,而相对较轻的3个地区为江苏、黑龙江、山东。对捻转血矛线虫ZJ株的15份样品进行系统进化分析显示,ITS-2和ND4基因在10年间均有不同程度的遗传变异发生,变异范围分别为0.0%~3.9%和0.4%~4.8%,而ND4突变程度较大可能是由于虫种固有差异引起的。而2种基因都有部分位点突变后与H.placei(Haemonchus pacei)相同,说明嘉兴地区可能存在捻转血矛线虫和H.placei交叉感染的情况。调查分析结果将为制定更合理的羊寄生虫病防控方案提供参考依据,并为寄生虫系统进化分析研究奠定基础。     

利用mRNA差异显示技术分离捻转血矛线虫感染性三期幼虫抗干燥相关基因

捻转血矛线虫感染性三期幼虫对干燥环境具有很强的抵抗力,环境适宜时可恢复到正常状态并继续感染宿主.为初步探讨捻转血矛线虫感染性三期幼虫抗干燥的分子机制,试验对该期幼虫施以不同干燥条件的处理,筛选出虫体存活率达到90％的干燥条件.在筛选到的条件下(相对湿度为50％,时间为60 h)处理虫体,采用mRNA差异显示技术分析干燥环境下培养的虫体和正常虫体的mRNA表达差异.经验证获得了48个差异表达的EST序列,其中25个(52.08％)序列与现有捻转血矛线虫基因组数据库有高度同源性；15个(31.25％)序列与已知线虫的cDNA序列或基因组序列有较高同源性；9个(18.75％)序列与其他线虫已知蛋白质氨基酸序列同源性较高.差异表达序列AF-U01C与多种线虫的蛋白酶体β亚基家族成员同源性达90％,差异表达序列AG-U01A与多种线虫的β酮脂酰CoA硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)同源性达65％.结果为进一步研究寄生性线虫抗干燥机制奠定基础.     

捻转血矛线虫ZJ株滞育虫体的获得及其形态特征

为进一步研究寄生性线虫的滞育机制,参照Adams(1986)的方法,通过瘤胃灌注,将捻转血矛线虫感染性三期幼虫攻入绵羊体内,对绵羊进行处理后,获得捻转血矛线虫滞育虫体。滞育虫体发育程度一致,虫体长(1 067±97)μm(n=18),肠道细胞中含有大量棒状结晶块;性腺开始发育,出现雌驱器原基;颈部出现颈乳突。通过温度检测分析,温度可能不是滞育现象的主要刺激因素。棒状结晶块可以被DAPI特异性着色,其成分可能含有核酸。本试验将为进一步研究捻转血矛线虫的滞育机制及其防治奠定基础。     

弓形虫环核苷酸依赖性蛋白激酶真核表达载体构建及在Vero细胞内的定位分析

为研究弓形虫环核苷酸依赖性蛋白激酶(PKAR)基因在Vero细胞内的定位情况,本研究构建弓形虫TgPKAR-RFP-C2真核表达质粒,并将其真核转染至Vero细胞内。试验中利用PKAR基因序列设计引物,以反转录获得的cDNA模板进行PCR扩增,成功获得目的片段,并构建克隆质粒pMD-PKAR。经BglⅡ和HindⅢ双酶切后构建真核表达质粒PKAR-RFP-C2,利用脂质体转染法将其导至Vero细胞内,利用Leica激光共聚焦显微镜观察PKAR基因在Vero细胞内的表达情况及其定位。结果显示,成功获得了PKAR基因,与GenBank公布的基因序列相似性为100%,并成功构建真核表达质粒及在Vero细胞内表达。Western blot试验成功检测到目的条带;激光共聚焦显微镜观察发现PKAR基因主要在Vero细胞的细胞质中呈点状表达。结果为进一步研究PKAR基因生物学功能及核酸疫苗研制奠定基础。     

富春江入库控制断面水位计算方法研究及误差分析

近年来受人类活动影响,富春江流域下垫面因子发生重大改变,传统水位流量关系无法应用。为应用水位比降法推求入库控制站有效入库流量,首先要对水位资料进行分析计算。以圣维南方程组为理论基础建立水动力学模型,考虑河道糙率的空间变异性,根据已有资料对富春江水库上游河道进行概化,模拟计算2013年女埠站洪水水位过程。同时采用经验相关法建立水位关系函数求解女埠站水位。2种方法模拟计算精度皆较高,水动力学方法在验证期洪峰模拟上优于经验相关法,而后者在洪水过程模拟上的确定性系数更高。由计算结果误差分析可知考虑水力要素时间变异性的水动力学模型能更好拟合退水过程,值得深入研究。