含马动脉炎病毒N基因的病毒样颗粒的制备

为了构建易于纯化且耐RNase酶的含有马动脉炎病毒N基因的病毒样颗粒,通过RT-RCR扩增马病毒性动脉炎病毒的N基因,将其克隆至含有组氨酸标签的pNH-MS2his载体中,构建重组原核表达载体pNH-MS2his-N。将重组质粒pNH-MS2his-N转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3),1 mmol/L IPTG诱导表达、纯化。对病毒样颗粒进行鉴定及稳定性实验。结果表明该病毒样颗粒含马病毒性动脉炎病毒N基因,并且稳定性良好,构建的病毒样颗粒可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品使用。     

马动脉炎病毒主要结构蛋白基区酵母工程菌的构建及鉴定

目的：构建马动脉炎病毒读码框ORF5、ORF6、ORF7主要结构蛋白基因全长片段的克隆载体及汉逊酵母穿梭载体，并获得重组工程菌，为下一步酵母表达重组目的蛋白奠定基础。方法：应用RT-PCR方法从病毒核酸中扩增ORF5、ORF6和ORF7读码框的全长基因，产物回收后分别与PUCl8和PMD18-T载体连接并转化DH5a E．coli，经氨苄筛选及测序，建立克隆载体PUC18-GL、PUC18-M和PMD18T-ORF7；以构建的克隆载体为模板，用重新设计的引物构建了汉逊酵母分泌性穿梭载体，然后电转化至汉逊酵母基因组中。结果：所有重组质粒经PCR和酶切鉴定均出现目的片段，测序结果证实正确，目的基因ORF5、ORF6与酵母重组成功。结论：构建了含有目的基因ORF5、ORF6的重组酵母工程菌，为实现分泌表达目的蛋白，进而研制病毒亚单位疫苗及诊断试剂提供了物质基础。     

定量检测马动脉炎病毒方法的建立

为建立快速、敏感、准确的马动脉炎病毒检测方法,笔者选取病毒基因组中高度保守的ORF7序列设计引物和TaqMan探针,分别使用马动脉炎病毒的总RNA和含有选定检测序列的克隆标准品进行一步法实时定量RT-PCR,绘制扩增曲线,两曲线斜率之差小于0.1,证明两者的扩增效率相同,可用选定检测序列的克隆标准品对马动脉炎病毒进行定量检测。     

马动脉炎病毒实时RT-PCR检测方法的建立

选取马动脉炎病毒基因组中高度保守的开放阅读框7序列,设计了特异性引物和TaqMan探针,利用一步法的实时定量RT-PCR来定量检测马动脉炎病毒.分别使用马动脉炎病毒的总RNA和含有选定检测序列的克隆标准品做扩增曲线,两曲线斜率之差小于0.1,证明两者的扩增效率相同,可用选定检测序列的克隆标准品对马动脉炎病毒进行定量检测.该方法敏感,快速,准确,且无交叉污染,能满足海关及检疫部门对马动脉炎病毒快速、准确的检测要求.     

马动脉炎病毒N蛋白基因GST融合表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法扩增出马动脉炎病毒核衣壳蛋白基因0RF7,并将其克隆到pMDl8-T载体,构建成重组质粒pMDl8-N,在上海生物工程公司测序。结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与EAVNC-002532株的同源性为99％。表明0RF7是EAV基因组内的保守序列,将0RF7亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组质粒pGEX-6P-N,用pGEX-6P-N转化表达菌株BL21（DE3）,诱导表达后SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,克隆在谷胱苷肽硫转移酶（GST）下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子质量约为40ku,为马动脉炎病毒病血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

马动脉炎病毒大囊膜糖蛋白真核表达载体的构建与瞬时表达

将马动脉炎病毒大囊膜糖蛋白基因GL插入真核表达载体pVAX1中构建真核表达载体pVAX1-GL，酶切和测序结果表明构建是正确的，用脂质体转染试剂将其转染BHK-21细胞并通过问接免疫荧光试验检测其在体外的表达情况，结果在转染的细胞表面观察到绿色荧光，证明基因得到了表达，而对照则无绿色荧光，本研究为马动脉炎基因疫苗的研究奠定了基础。     

马动脉炎病毒主要结构蛋白基因酵母工程菌的构建及鉴定

目的:构建马动脉炎病毒读码框ORF5、ORF6、ORF7主要结构蛋白基因全长片段的克隆载体及汉逊酵母穿梭载体,并获得重组工程菌,为下一步酵母表达重组目的蛋白奠定基础.方法:应用RT-PCR方法从病毒核酸中扩增ORF5、ORF6和ORF7读码框的全长基因,产物回收后分别与PUC18和PMD18-T载体连接并转化DH5α E.coli,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体PUC18-GL、PUC18-M和PMD18T-ORF7;以构建的克隆载体为模板,用重新设计的引物构建了汉逊酵母分泌性穿梭载体,然后电转化至汉逊酵母基因组中.结果:所有重组质粒经 PCR和酶切鉴定均出现目的片段,测序结果证实正确,目的基因ORF5、ORF6与酵母重组成功.结论:构建了含有目的基因ORF5、ORF6的重组酵母工程菌,为实现分泌表达目的蛋白 ,进而研制病毒亚单位疫苗及诊断试剂提供了物质基础.     

实时定量RT-PCR检测马动脉炎病毒

选取马动脉炎病毒(EAV)基因组中高度保守的开放阅读框7(ORF7)序列，设计了特异性引物和TaqMan探针，利用一步法的实时定量RT-PCR来定量检测EAV。使用含有选定检测序列的克隆标准品做标准曲线，证明该方法可以检测出含有5(4．77)个RNA分子，即可从组织培养液(TCF)中检出一般含有5PFU／μL病毒拷贝。对猪生殖呼吸道综合征病毒、马疱疹病毒无交叉反应，特异性好。用疫苗用种毒(Bucyrus标准株)肌肉注射于马驹后，定量RT-PCR比病毒分离试验更能灵敏地检出呼吸道排出的病毒。对456份临床鼻腔分泌物样品检测，定量RT—PCR检出6份阳性，而病毒分离只检出2份阳性。一步法实时定量RT—PCR检测样品中的EAV，在快捷、准确、方便和高通量方面优于细胞培养病毒分离的检测方法，可以作为检测马病毒性动脉炎(EVA)病毒的快速方法。     

马动脉炎病毒进化分析及DNA条形码的确定

从GenBank数据库下载马动脉炎病毒所有基因组全序列和同属的其他病毒基因组序列,对其进行多重比对,绘制系统进化树,并根据序列比对筛选保守序列作为马动脉炎病毒的DNA条形码。结界发现马动脉炎病毒分为两个分枝,即欧洲型和美洲型,两者同源性在85%以上,而与同属其他病毒同源性低于40%,亲缘关系较远;对马动脉炎病毒基因组序列进行分析,筛选出9条基因序列作为马动脉炎病毒的DNA条形码,可用于马动脉炎病毒的鉴别诊断。     

马动脉炎病毒大囊膜蛋白和膜蛋白基因的克隆与序列分析

参考GenBank收录的马动脉炎病毒(EAV)读码框大囊膜蛋白基因oRF5、膜蛋白基因ORF6的核苷酸序列，分别设计了2对引物，对EAV的这两种主要结构蛋白基因进行了RT—PCR；将扩增产物克隆于pUC18通用载体，对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序，证实克隆片段的可靠和准确性。测序结果，ORF5目的片段包含768bp，编码255个氨基酸组成的多肽；ORF6目的片段包含489bp，编码162个氨基酸组成的多肽。与EAVNC-002532标准毒株比较，ORF5、ORF6核苷酸的同源性分别为99．1％和99．4％；推导氨基酸的同源性分剐为96．99／6和98．29／6。     

乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒的构建

以乙型脑炎病毒SA14-14-2株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增prM／E基因的全长cDNA(约2kb)，将其克隆至pMDl8一T栽体，获得了克隆质粒pTprM／E，并对其进行了测序。序列分析结果表明，与已报道的SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸比较，prM基因的序列同源性为100％，E发生了4个点突变，其中1个为回复突变，并导致了3个氨基酸的改变。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^ 突变株为栽体，构建了1株乙脑病毒prM／E基因的重组伪狂犬病病毒TK／gG^-／ΓrM／E^ 。乙脑病毒prM／E基因的克隆及重组伪狂犬病病毒的成功构建，为开展乙脑病毒分子生物学及猪伪狂犬病-乙脑二价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒XH株感染性克隆的构建

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作系统,本实验采用RT-PCR方法将PRRSV-XH株的基因组序列分为6个片段进行扩增,连接至低拷贝载体pOKQ中,获得全长cDNA克隆。将该克隆体外转录,经脂质体转染Marc-145细胞,观察细胞病变。经RT-PCR、间接免疫荧光和western blot等试验验证,表明构建了具有感染性的PRRSV-XH株全长cDNA克隆。本实验为在分子水平上研究PRRSV的复制、致病机理和基因产物的功能等方面提供技术支持,并为构建新型病毒载体和开发安全有效的活病毒疫苗奠定基础。     

荧光素酶标记狂犬病病毒的反向遗传学

通过分子生物学技术克隆萤火虫荧光素酶(Luciferase)基因完整开放阅框后将其定向亚克隆入狂犬病病毒HEP-Flury株全长基因组中的假基因区域,经PCR、双酶切及测序证实构建了嵌有荧光素酶基因的狂犬病病毒全长cDNA感染性克隆。之后,利用反向遗传操作技术进行病毒拯救,抗核蛋白单抗直接免疫荧光染色结果显示,成功拯救了携荧光素酶基因的重组狂犬病病毒rHEP-luc株,RT-PCR证实插入的荧光素酶基因能够稳定遗传;荧光素酶活性分析显示,荧光素酶基因成功表达并具有良好生物学功能;这为应用活体成像技术研究荧光素酶标记狂犬病病毒在小鼠体内侵染移行规律奠定了基础。     

传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达

将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒（ILTV）糖蛋白gB基因，通过EcoRI位点克隆至杆状态病毒转移载体pVL1393中，构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB，将rpVLgB转移载体质粒与杆状态病毒DNA（Bac-N-Blue DNA)共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑纯化，获得重组病毒并命名为rpVL－ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中，直接免疫荧光试验和Dot－ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞保获得表达，表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。     

马动脉炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据已报道的马动脉炎病毒基因组保守基因核苷酸序列，设计并合成了1对引物，通过对影响PCR扩增因素的筛选，成功地从病毒感染的细胞中扩增出约200bp的片段，与理论设计值(204bp)大小一致。而正常的RK-13、BHK-21和Vero细胞和同为动脉炎病毒科的猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)作为对照的扩增结果均为阴性。敏感性试验表明，该方法可以检测出10^-4个TCID50的病毒含量，说明具有较好的敏感性。     

应用Gibson Assembly方法构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆

应用Gibson Assembly连接法精确快速构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆,为狂犬病病毒感染性cDNA克隆的构建提供新的方法。应用Gibson Assembly连接法在同一反应体系内,将多个片段和经限制性内切酶线性化的载体,按设计的顺序进行连接,实现多个片段的一步组装。设计带有20bp~30bp重叠序列的PCR引物,扩增得到带有重叠序列的狂犬病病毒5个结构蛋白基因和增强型荧光蛋白基因。扩增的片段和线性化的载体经胶回收纯化后,与Gibson连接液混合后,50℃反应60min,连接产物转化Stbl3感受态细胞,提取重组质粒,经PCR、酶切和测序鉴定,缺失了病毒伪基因Ψ区和糖蛋白基因的跨膜区并且将增强型荧光蛋白基因插入糖蛋白基因终止密码子前,构建了全长17 600bp的重组质粒,完成了重组全长感染性cDNA克隆的构建。     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒的研究

为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒截短型GP3蛋白的原核表达

<正>猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的高度传染性疾病。该病已经成为影响国内养猪业最主要的也是最为棘手的疾病[1]。PRRSV是含有包膜的单股正链RNA病毒,属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属[2]。PRRSV基因组含9个开放阅读框(ORF),从基因组     

表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建

本研究以乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA（558 bp），用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物，回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中，获得了转移载体pPgG-PrM，并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明：与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较，PrM基因的同源性为100％。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^＋突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／PrM^＋，为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。