羊痘病毒载体研究进展

羊痘病毒能引起山羊痘、绵羊痘和牛的结节性疹块病。羊痘病毒基因组较大,可容纳较大的外源基因。重组病毒载体是当今病毒基因工程研究的热点之一,目前以动物病毒为基础设计的基因克隆及表达载体主要有取代型的重组病毒载体和重组的病毒-质粒载体。作者综述了羊痘病毒载体构建策略和羊痘病毒活载体疫苗研究的最新进展。     

乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒的构建

以乙型脑炎病毒SA14-14-2株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增prM／E基因的全长cDNA(约2kb)，将其克隆至pMDl8一T栽体，获得了克隆质粒pTprM／E，并对其进行了测序。序列分析结果表明，与已报道的SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸比较，prM基因的序列同源性为100％，E发生了4个点突变，其中1个为回复突变，并导致了3个氨基酸的改变。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^ 突变株为栽体，构建了1株乙脑病毒prM／E基因的重组伪狂犬病病毒TK／gG^-／ΓrM／E^ 。乙脑病毒prM／E基因的克隆及重组伪狂犬病病毒的成功构建，为开展乙脑病毒分子生物学及猪伪狂犬病-乙脑二价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。     

重组伪狂犬病病毒疫苗的研究进展

随着分子生物学技术的发展及对伪狂犬病病毒(PRV)研究的不断深入, 伪狂犬病病毒载体的研究已成为病毒载体研究领域的热点之一.通过基因工程技术使伪狂犬病病毒的毒力基因失活构建表达外源基因的重组质粒,再通过同源重组获得毒力减弱但仍具有良好免疫原性的重组病毒,重组病毒疫苗在动物体内的表达不仅十分安全,而且还可以一针多防,提高生产效率.文章对以伪狂犬病病毒为载体研制重组疫苗的研究进展进行了综述.     

新城疫病毒载体研究进展

随着反向遗传学操作技术的发展,重组新城疫病毒载体成为当今病毒载体系统研究的热点之一.论文在综述了新城疫病毒的安全性评价、分子生物学特性的基础上,着重介绍了以新城疫病毒作为病毒载体表达外源基因应用于基础研究、疫苗研究和作为基因治疗载体等研究概况.     

无病原性腺病毒载体构建的研究

以小鼠腺病毒作为无病原性“孤儿病毒”的模型,进行了构建真核细胞基因工程载体的研究。通过对小鼠腺病毒DNA的提取、酶切和克隆,将病毒DNA片段插入pBR322质粒中,从中选出重组质粒pBAD-8,进而在病毒DNA的BglⅡ单一切口处,插入Ⅰ型单纯疱疹病毒TK基因,构成新的重组质粒pBAT。将重组质粒pBAT和野生小鼠腺病毒在TK~-的3T3细胞内进行同源重组,使TK基因插入小鼠腺病毒的DNA序列中。通过选择性培养基培养及α-~(32)P标记的核酸探针检测,证明在经同源重组的小鼠腺病毒DNA中插入了TK基因,并得到了表达。将重组病毒接种小鼠,进行体内存留实验,结果表明所构建的小鼠腺病毒载体在小鼠体内至少可存活40d。     

减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗诱导对新城疫病毒的免疫保护

探讨了以减毒鼠伤寒沙门氏茵为栽体传递新城疫病毒DNA疫苗的安全性、免疫原性和可行性。将含新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pcDNA3-F的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株(ZJ111／pcD-NA3一F菌株)，以10^8CFU进行首免，2周后二免，三免后4周攻击强毒株F48E9，观察其安全性和免疫原性，同时设只含空载体pcDNA3的ZJ111／pcDNA3菌株对照及口服PBS对照。结果表明：重组ZJ111／pcDNA3-F菌株具有良好的安全性。对强毒株攻击的保护率达64．7％。重组ZJ111／pcDNA3-F菌株不仅能诱导雏鸡产生NDVELISA抗体，而且诱导产生的法氏囊B淋巴细胞和胸腺T淋巴细胞增殖反应显著高于ZJ111／pcDNA3时照组。这些结果提示，减毒沙门氏菌为载体不仅可直接将NDVF基因呈递给鸡体细胞进行表达，产生抗NDV的体液免疫，而且还可诱导细胞免疫应答。     

山羊痘病毒ORF8～ORF18缺失重组毒株的构建和鉴定

本研究旨在通过敲除山羊痘病毒(GTPV)大段基因组片段尝试构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体.采用PCR方法,克隆了GTPV AV41株基因组ORF7～ORF8间1 242 bp的基因片段,以及ORF18～ORF19间1 355 bp的片段.接着分别以上述2片段作为左、右侧同源重组臂,构建了包含报道基因EGFP和抗性基因gpt的GTPV重组转移载体pCF-Eg.然后采用脂质体介导法,将重组转移载体pCF-Eg与GTPV AV41株共转染原代羊睾丸细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,并鉴定重组病毒的遗传稳定性和生长特性.结果成功获得1株敲除掉ORF8～ORF18间9个ORF、长达7 kb基因组片段的重组病毒vCF-Eg.该重组病毒能稳定表达绿色荧光蛋白至少10代,并且其增殖滴度与亲本毒株基本相同.表明上述区域是GTPV的复制非必需区.     

PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础.     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒栽体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

重组辛德毕斯病毒E基因痘苗病毒的构建

为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。     

伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株的构建

在伪狂犬病病毒转移载体pBdTK-Uni的多克隆位点中插入由SV40启动子控制下的IacZ基因表达盒,同时在右侧同源臂下游插入一个1.7kb的KpnI片段,构建成一个新的转移载体pUhi-LacZ.用该载体与Bartha-K61株基因组通过脂质体法共转染Vero细胞,经过10代蓝斑筛选纯化和PCR鉴定获得了一株稳定表达LacZ基因的伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株,命名为rPrV-LacZ.在不同的细胞(PK-15、IBRS-2、Vero和CEF)上,对该重组病毒与亲本病毒的增殖滴度和细胞病变进行比较,未见显著差异.结果表明转移载体pBdTK-Uni具有实用性,可用于构建伪狂犬病病毒基因工程活载体疫苗.     

表达鸡新城疫病毒F蛋白的重组马立克氏病毒的构建及其鉴定

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的重组马立克氏病毒(MDV),本研究采用RT-PCR方法从NDV强毒株F48E9基因组中扩增出病毒的融合蛋白F基因,构建由CMV启动子和BGH polyA组成的2.7 kb F基因表达盒。将其插入带有黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)和MDV US2同源臂的中间转移载体pUAB-gpt中获得重组MDV转移载体pUAB-gpt-wF。将该转移载体与MDV-814疫苗株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)总DNA共转染CEF,经同源重组及gpt选择系统筛选,获得带有F基因表达盒的重组MDV(rMDV814-wF)。其体外增殖与亲本病毒没有差异。经间接免疫荧光试验、PCR、Southern-blot及western blot等试验证明,重组病毒在CEF中传至13代以上仍稳定表达NDV的F蛋白。该重组病毒的构建为MDV活载体疫苗的筛选及应用奠定了基础。     

表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。     

表达口蹄疫病毒P1基因的重组伪狂犬病病毒TK/gG-/PgG-P1的构建

为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础     

表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建

为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建

从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。