瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白     

T7 RNA多聚酶基因的克隆、序列测定及其在E.coli中的表达

从BL21(DE3)E．coli菌株中以PCR的方法扩增得到了与T7RNA多聚酶(T7RNApolymerase，T7pol)基因大小一致的DNA片断。将PCR产物纯化后直接克隆到pGEM—T载体中，经酶切鉴定和DNA序列分析表明克隆得到了正确的T7pol基因。将T7pol基因亚克隆入pET-28b( )中，构建得到原核表达质粒pET28T7。该质粒的BL21(DE3)pLysS转化菌在IPTG的诱导下可表达约98800的蛋白，这与T7pol的相对分子质量一致。将该质粒转化DH5α、JMl09、HBl01、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS等5种不同的宿主菌，仅有转化T7pol酶活性受到抑制的宿主菌BL21(DE3)pLysS才能得到转化子，而其余4种T7T7pol酶活性不受抑制的E．coli宿主菌不能得到转化子。pET28T7原核表达质粒这种仅能在T7pol酶活性受到抑制的宿主菌中才能存活的现象说明本试验所克隆的T7pol基因能正确表达出具有RNA转录酶活性的蛋白。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的表达

将 2种抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 ( Sc Fv)基因 Sc Fv-2 E3和 Sc Fv-1 A8克隆至表达载体p UC1 1 9、p HOG2 1和 p ET2 0 b中 ,构建了重组质粒 p UC2 E3和 p UC1 A8、p HOG2 E3和 p HOG1 A8、p ET2 E3和 p ET1 A8后 ,分别转化至受体菌 JM1 0 5、JM1 0 9和 BL2 1 ( DE3 )中 ,得到重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)、JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)及 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 )( p ET1 A8)。 ELISA检测表明 ,经 IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株 JM1 0 5( p UC2 E3 )和JM1 0 5( p UC1 A8)及 JM1 0 9( p HOG2 E3 )和 JM1 0 9( p HOG1 A8)的菌培养上清中 ,在重组菌株 BL 2 1 ( DE3 )( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的胞周质中检测到了 Sc Fv的存在。 SDS-PAGE和薄层扫描分析表明 ,重组菌株 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET2 E3 )和 BL2 1 ( DE3 ) ( p ET1 A8)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 0 .9%和 0 .7%,其大小约为 2 60 0 0 ,且表达的目的蛋白具有中和磷脂酶 C的活性。     

猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白的原核表达、纯化及活性检测

在大肠杆菌BL21(DE3)中表达乙脑病毒(JEV)EDⅢ蛋白、镍柱纯化并检测表达蛋白。采用RT-PCR方法扩增EDⅢ基因片段,构建重组表达载体p ET-28a-EDⅢ并转化到BL21(DE3)菌,经IPTG诱导蛋白表达,表达可溶性产物经NiNTA亲和层析纯化,最后通过SDS-PAGE和Western-Blot检测表达蛋白。结果成功构建原核表达载体p ET-28a-EDⅢ;EDⅢ蛋白在BL21(DE3)菌已表达,经Ni-NTA获得纯化蛋白,并经Western-Blot检测具有反应活性。     

羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。     

布鲁菌外膜蛋白Omp22基因的原核表达与生物信息学分析

克隆布鲁菌Omp22基因,原核表达后进行生物学信息分析。根据GenBank中羊种布鲁菌M5-90株基因组PCR扩增出639bp的目的基因片段,构建克隆重组质粒pMD-20T-Omp22,转化入E.coli DH5α。测序正确后构建表达重组质粒pET-28a-Omp22,转化入E.coli BL21(DE3)。IPTG诱导表达,Western blot鉴定诱导融合蛋白。结果表明,成功克隆Omp22基因,构建pET-28a-Omp22原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达Omp22基因。DNA Man和BIOEDIT软件生物性息学分析Omp22融合蛋白二级结构中α-螺旋占22.17%;伸展链占19.81%;β-折叠占2.83%;无规卷曲占55.19%。说明该蛋白具有较高亲水性。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆和表达

通过RT-PCR方法克隆出GD株Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)的结构蛋白VP1基因片段,VP1基因片段和原核表达载体pMAL-C2X均以EcoRⅠ、HindⅢ双酶切后构建获得重组质粒pMAL-C2X-VP1,经限制性酶切和序列测序证明,目的基因正确插入表达载体,转入E.coli BL21(DE3),构建重组表达菌E.coliBL21/pMAL-C2X-VP1,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明,DHV-1的结构蛋白VP1能在E.coliBL21(DE3)中表达,获得可溶性重组蛋白,表达产物的分子质量约为69ku。     

羊种布鲁氏菌Omp10基因的克隆及原核表达

根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis) M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381 bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测序正确后,构建pET-28a-Omp10原核表达质粒,再将该质粒转化入E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达融合蛋白His-Omp10,用SDS-PAGE和Western blotting进行分析.结果表明, 成功构建了含Omp10基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了Omp10基因,诱导得到的融合蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明Omp10得到成功表达.该试验为布鲁氏菌病的进一步研究奠定基础.     

鸡催乳素和抑制素-α亚基重组蛋白的构建及表达

将鸡催乳素 (PRL)和抑制素 - α亚基 (INB- α)基因编码序列重组为融合基因 ,制备了同时包含这 2种激素基因的融合蛋白。通过 PCR和分子克隆的方法首先将全部粤黄鸡 PRL成熟肽 c DNA克隆到载体 p RSET A的 Bgl 和 Eco R 克隆位点之间 ,获得重组质粒 p PRL- RSET。鸡 INB- α片段经扩增后分别被克隆到质粒 p RSET A和 p PRL- RSET的 Nhe 和 Xho 克隆位点之间 ,获得重组质粒 p INB- RSET和 p INB- PRL。以上重组质粒构建的正确性分别由各特定引物组合扩增的 PCR产物长度、特定限制性内切酶消化各重组质粒所得产物长度以及对各质粒的测序结果得到验证。重组质粒 p PRL- RSET和 p INB- PRL 转化 E.coli BL2 1(DE3)株 ,IPTG诱导后所表达的产物经 SDS- PAGE显示 ,其分别与所预期的重组蛋白分子大小相符。质粒 p PRL - RSET和 p INB- PRL的表达产物和用 Ni- NTA凝胶纯化的 2重组蛋白产物都可与抗鸡 PRL 抗体产生特异的免疫印迹 ,并且表达菌裂解液和相应纯化蛋白的免疫印迹处于同一位置。结果说明 ,试验已成功完成了鸡 PRL、INB-α及 2者融合蛋白的构建、表达和纯化     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.     

抗菌肽对抗生素耐药菌株的抑菌活性研究

[目的]研究抗菌肽对抗生素耐药菌株的抑菌活性。[方法]利用抗性平板划线法从腹泻病牛血便中筛选分离出1株耐药菌,通过16S rDNA序列进行鉴定,采用琼脂孔穴扩散法通过梯度盐酸壮观霉素（spectinomycin,Spe⁺）、氨苄青霉素（ampicillin,Amp⁺）、硫酸卡那霉素（kanamycin,Kan⁺）和氯霉素（chloramphenicol,Cm⁺）试验确定该菌药敏特性,并利用1种抗菌肽制剂对该菌株进行药敏试验。[结果]经BLAST比对分析该菌16S rDNA序列,鉴定该耐药菌为科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）,此菌对Amp⁺敏感,但对试验中其他抗生素均有耐药性,各梯度抗菌肽对该耐药菌均具有明显的抑菌活性。[结论]抗菌肽能有效抑制耐药科氏葡萄球菌的生长,有望在畜牧生产中代替抗生素使用。     

传统乳制品中-产细菌素乳酸乳球菌的筛选

采用平板挖井扩散法对从内蒙古传统乳制品中分离鉴定的34株乳酸菌的细菌素产生特性进行研究。在排除有机酸和过氧化氢的干扰后发现，一株乳酸乳球菌CB20—2的发酵上清液对革兰氏阳性60乳酸菌和非乳酸菌显示出抑菌活性，但对革兰氏阴性菌无抑菌作用。其蛋白特性及广谱抑菌性表明乳酸乳球菌CB20—2产生的抗菌物质是一种细菌素。     

兽用合成抗菌药的安全使用

抗菌药物在保障畜禽健康、促进畜禽生长、提高经济效益方面起了积极的作用。然而长期使用,具有危害性。首先,导致细菌产生耐药性;其次,敏感菌得到了控制,不敏感菌或耐药菌乘机大量繁殖,产生新的致病菌,     

一株干酪乳杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

本研究旨在分离既能用于微生态制剂又能用于青贮饲料发酵剂的优良乳酸菌,采集规模化牛场青贮饲料,取梯度稀释液涂布MRS平板,进行厌氧培养,筛选优势菌株,观察其菌落形态,并进行生化试验和特异性PCR鉴定。研究自筛乳酸菌的生长曲线、产酸曲线、培养温度及培养基初始pH对菌株生长的影响,并研究其抑菌特性、药物敏感性和安全性。试验筛选到1株菌落形态圆形、边缘整齐、表面光滑、乳白色、镜检为革兰氏阳性的无芽孢杆菌。生化结果显示,分离菌株可厌氧生长,运动性试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验结果均为阴性,15种糖醇发酵试验结果符合干酪乳杆菌生化特征。用干酪乳酸杆菌特异性引物对菌株进行PCR鉴定,琼脂糖凝胶电泳结果显示在727 bp处出现特异性扩增条带,与生化鉴定结果相符,将分离菌株命名为RS1。RS1在0~4 h时发酵液pH变化不明显,处于生长延迟期;4~16 h时发酵液pH下降较快,进入对数生长期;16~36 h时发酵液pH下降缓慢,进入稳定期。RS1在培养温度为20~50 ℃范围内均能生长,适宜生长温度为25~40 ℃;在培养液初始pH 1.0~9.0条件下均能生长,最适pH为6.0~8.0;对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为23 mm,对大肠杆菌的抑菌圈直径为17 mm;对恩诺沙星和头孢他啶耐药;经14 d灌服小鼠生长状况良好。上述结果表明,本试验筛选到的干酪乳杆菌RS1安全、无致病性,在微生态制剂及生物饲料添加剂领域具有潜在的开发价值。     

载铜蒙脱石体外杀菌效果及其机理

选用断奶仔猪肠道中的大肠杆菌K88和猪霍乱沙门菌作为指示菌。杀菌性能的测定采用最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,并绘制杀菌曲线。原子吸收光谱仪测定Cu2＋在肉汤和生理盐水中的释放量;透射电镜观察细菌细胞壁的变化;全自动生化分析仪测定细菌胞内酶的活性;通过K＋电极测定K＋释放量;采用SP-2型溶氧仪测定菌体悬浮液中的溶氧量。结果显示,载铜蒙脱石对E.coli K88的MIC为64mg/L,MBC为256mg/mL;对S.choleraesuis的MIC为128mg/L,MBC为512mg/L。而蒙脱石未显抗菌活性。透射电镜下观察细菌与载铜蒙脱石作用后形态发生了变化,细菌细胞膜受损,内容物外漏;细菌胞内酶活性结果显示,胞内酶的大量外漏,与对照组相比,均差异极显著（P〈0.01）;大量自由的K＋从细菌细胞内释放出来;呼吸代谢结果显示,载铜蒙脱石抑制了细菌呼吸代谢的三羧酸循环途径。结果表明,载铜蒙脱石具有强大的杀菌作用。     

柑橘类植物精油的抗菌活性及其作用机制

柑橘类植物精油(CEOs)是从柑橘类植物中提取的芳香类混合物,其主要活性成分为D-柠檬烯(D?limonene),具有广泛的生物活性,包括抗菌、抗氧化和抗炎等.CEOs具有选择性抗菌活性,在动物生产中具有非常重要的应用价值.不同的CEOs具有不同的抗菌活性,研究其抗菌机制也具有非常重要的意义.本文着重介绍了CEOs的化...     

喷雾干燥细菌素的生物学活性研究

为了初步研究前期试验筛选获得的枯草芽孢杆菌产细菌素的生物学活性,本试验采用杯碟扩散法绘制出硫酸黏杆菌素和杆菌肽锌两种抗生素的抑菌效价标准曲线,用抗生素效价当量来评价细菌素的活性,并在不同温度处理下测定其抗菌活性和热稳定性。结果表明,125 mg/mL细菌素溶液抑菌效价与26 mg/mL硫酸黏杆菌素或11.9 mg/mL杆菌肽锌溶液相当。此外,该细菌素在高温条件下(60~80 ℃)处理15 min仍能维持较高抑菌活性。综上所述,本试验在细菌素和抗生素的抑菌活力之间建立了更直观的联系,并证明了该细菌素具有较好的热稳定特性,为其产业化推广提供了理论支持和技术借鉴。     

Study on the Biological Activity of a Spray Dried Bacteriocin

The standard curve of two antibiotics (colistin sulfate and bacitracin zinc) was carried out to assess antimicrobial activity of bacteriocin,which obtained from our earlier work,using cup-dish method.In addition,we also observed the effects of the reaction temperature on the antibacterial activity of the bacteriocin.Results showed that 125 mg/mL bacteriocin displayed similar antibacterial activity to 26 mg/mL colistin sulfate or 11.9 mg/mL bacitracin zinc.Furthermore,the bacteriocin remained good thermal stability under high temperature (nearly 60 to 80 ℃) in 15 minutes.Overall,this research built a direct relationship between this bacteriocin and antibiotics,and testified good stablility of this bacteriocin,providing theoretical support and technology reference to promote its large scale production.     

嗜驼璃眼蜱抗菌肽的电泳分析及抗菌活性研究

为探讨嗜驼璃眼蜱血淋巴中抗菌肽的电泳分析方法及其抗菌作用，从半饱血的嗜驼璃眼蜱雌蜱体内抽取血淋巴，用50mL／L的乙酸抽提，经AU—PAGE分析嗜驼璃眼蜱血淋巴中阳离子多肽成分，用电泳凝胶琼脂糖弥散法对各多肽进行抗菌活性的筛选。结果表明，嗜驼璃眼蜱血淋巴中阳离子多肽成分对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有很强的抗菌作用。AU—PAGE发现一电泳迁徙率明显高于溶菌酶的阳离子抗菌多肽。提示在嗜驼璃眼蜱的血淋巴中，存在与溶菌酶不同的抗菌多肽，可能是嗜驼璃眼蜱抵御感染的重要分子。AU—PAGE是一种较简单、快速、经济的分离纯化抗菌肽的方法。     

包合技术增强抗菌药物抗菌疗效研究进展

细菌性疾病严重危害动物机体健康，影响畜牧养殖业经济利润。抗菌药物已诱导多种细菌产生耐药性，这在一定程度上降低了其治疗效果。然而，通过提高抗菌药物使用剂量以加强疗效不仅容易引起毒副作用，还易导致药物残留。因此，寻找新方案来提升传统抗菌药物的抗菌活性成为药物研究者工作重点。以传统抗菌药物作为客体分子，利用包合技术将其同价格低廉的环糊精等主体分子制成包合物，可改善药物理化性质及抗菌活性，显示出良好发展前景。包合物不仅能改善药物溶解性、稳定性，还兼具备缓释效果，可有效提高抗菌药物生物利用度。同时，其还能与细菌膜结合，协助抗菌药物穿越膜结构，最终提高药物抗菌效果并降低抗菌药物使用剂量。本文将从包合技术的发展历史、增强抗菌药物活性应用现状以及提高抗菌药物药效学机制三个方面进行总结，以期为兽药研究者提供有效的借鉴。