小鼠TRIM59蛋白多克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

【目的】制备兔抗鼠三结构域蛋白59(Tripartite motif-containing 59,TRIM59)多克隆抗体。【方法】利用PCR方法得到小鼠TRIM59基因片段,将其克隆至pGEX-2T原核表达载体中,转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达GST-TRIM59融合蛋白。GST-TRIM59融合蛋白经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA测定兔抗鼠TRIM59多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性。用免疫组织化学方法检测TRIM59在小鼠前列腺癌组织中的表达。【结果】成功构建了pGEX-2T-TRIM59原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-TRIM59融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体。ELISA测定结果表明,TRIM59多克隆抗体效价为1∶106以上;Western blot分析表明,TRIM59多克隆抗体具有良好的特异性。免疫组织化学检测发现,TRIM59在小鼠前列腺癌组织细胞中高表达。【结论】成功地制备了特异性良好的兔抗鼠TRIM59多克隆抗体,其具有良好的免疫学活性,能够用于相关研究。     

新型免疫分子TRIM23参与斑马鱼 抗嗜水气单胞菌免疫应答

为获得纯化的斑马鱼TRIM23(tripartite motif 23)重组蛋白并研究其免疫功能,试验采用逆转录PCR(RT-PCR)技术扩增TRIM23全长序列,将其与原核表达载体pGEX-4T-1连接并转化至E.coli Rosetta感受态细胞,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用谷胱甘肽巯基转移酶(GST)蛋白纯化介质纯化目的蛋白后,将其与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)孵育,检测抑菌活性。结果显示,重组表达载体pGEX-TRIM23在宿主菌Rosetta中表达出约91 ku的重组蛋白,且蛋白部分以可溶形式存在于上清中,经体外抑菌试验检测发现,TRIM23蛋白能够抑制嗜水气单胞菌的增殖。基于以上研究,推测TRIM23在斑马鱼抗细菌免疫应答过程中发挥作用。     

重组α-银环蛇毒素融合蛋白的诱导表达及表达条件的优化(英文)

[目的]获得有活性的重组α-银环蛇毒素(alpha-bungarotoxin,α-BGT)融合蛋白。[方法]将质粒pGEX-α-BGT转入BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS等宿主菌中确定最佳工程菌,并对工程菌进行诱导表达,优化可溶性蛋白的诱导表达条件。[结果]确定JP-α-BGT为表达工程菌,并检测到融合蛋白的表达;可溶性蛋白的最佳诱导表达条件:37℃重培养2.5h后,于22℃以0.50mmol/L的IPTG诱导4h,此时其可溶性融合蛋白的表达量达18.42%。[结论]该研究为后续融合蛋白纯化及α-BGT的分离纯化奠定了坚实基础。     

重组猪 α干扰素工程菌的诱导表达及产物纯化

为获得大量猪α干扰素的重组蛋白,研究了其发酵条件,并对目的蛋白进行分离纯化。考察了不同IPTG诱导浓度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L)、不同诱导温度(17、27、32、37℃)、不同诱导时间(0、2、3、4、5、6、7、8 h)对目的蛋白表达的影响;同时对包涵体进行提取、溶解变性进行研究,最后采用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。采用SDS-PAGE电泳及Image Pro Plus 6.0软件分析电泳结果,结果显示,IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L、诱导温度为27℃、诱导时间为6 h时,目的蛋白表达量最多;超声波破碎细菌的最优时长循环为10 s/10 s;8 mol/L尿素溶解包涵体过夜可得到大量可溶性目的蛋白含量,Ni柱亲和层析后可去除大量杂蛋白,获得较纯的目的蛋白。可见本试验通过优化重组猪α干扰素诱导表达条件及纯化方法,获得了高表达、高纯度的重组猪α干扰素蛋白,为今后研究其生物活性奠定了初步基础。     

TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达及其功能初探

【目的】研究TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达情况及其沉默后对早期胚胎体外发育的影响。【方法】采用RT-PCR、免疫印迹分别检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、子宫、卵巢和睾丸）中的表达情况,采用免疫组化技术对TRIM8在卵巢中进行定位。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫印迹法检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠早期胚胎（1-细胞胚胎、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚）中的表达规律,用免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术对TRIM8在早期胚胎中进行定位。利用RNA干扰技术沉默TRIM8基因,研究该基因沉默对小鼠早期胚胎体外发育的影响。【结果】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织中均表达,但在子宫、卵巢和睾丸中表达水平相对较高。在卵巢中,TRIM8蛋白主要定位在不同发育阶段的卵母细胞中。TRIM8基因及其编码的蛋白在早期胚胎中均有表达,但其mRNA表达水平在1-细胞到4-细胞期胚胎中的表达水平显著高于8-细胞到囊胚期胚胎。TRIM8蛋白主要定位在不同时期胚胎的胞质中。TRIM8基因沉默组的囊胚率显著低于对照组(P<0.05)。【结论】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠各组织及早期胚胎中均有表达,主要定位在早期胚胎的胞质中;沉默TRIM8基因会显著降低囊胚发育率。TRIM8可能参与调控小鼠早期胚胎的发育进程。     

猪IFN-α8的原核表达及抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性研究

为确定猪干扰素α8(poIFN-α8)蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的抗病毒作用，合成poIFN-α8基因，克隆入pCSMH大肠杆菌表达载体，将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，进行温度诱导表达后，收集菌体进行SDS-PAGE电泳。将表达的目的蛋白利用Ni-琼脂糖凝胶纯化柱纯化后，采用Western blot试验检测重组poIFN-α8的反应原性，利用猪肺泡巨噬细胞（PAM）检测0.01、0.05、0.1、1 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白对PRRSV的抗病毒活性，并检测重组poIFN-α8蛋白对下游干扰素刺激基因（ISG）Mx1、OAS1、ISG15的诱导激活作用。结果表明，成功构建了pCSMH-IFN-α8表达载体，实现了poIFN-α8在大肠杆菌中的包涵体表达，且重组poIFN-α8蛋白具有良好的反应原性；0.05 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白可显著抑制PRRSV在PAM中的复制，poIFN-α8的抗病毒效果显著优于猪干扰素α2(poIFN-α2)、猪干扰素α5(poIFN-α5)，且重组poIFN-α8能有效激活ISG的表达。综上，表达的重组poIF...     

新城疫病毒HN蛋白的酵母表达及其活性鉴定

为了制备新城疫病毒(NDV)HN蛋白并研究其免疫原性,将优化的HN基因胞外区插入毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-HN,并将其电转入毕赤酵母X-33感受态中,经PCR鉴定得到阳性转化子,甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot鉴定筛选出目的蛋白表达菌株;通过对诱导剂含量、诱导时间、培养基初始pH值和诱导温度进行优化,研究最佳表达条件;采用镍柱亲和层析对目的蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA对目的蛋白进行鉴定;利用去糖基化酶PNGase F对目的蛋白进行处理,验证其糖基化修饰程度。结果显示,HN重组蛋白在毕赤酵母中成功表达,且在28℃条件下,培养基初始pH值为7.0,用0.5%甲醇诱导5 d,蛋白质表达量最高;通过镍柱亲和层析可获得纯度高于90%的重组蛋白;间接ELISA结果表明,重组蛋白活性良好;去糖基化试验验证了重组蛋白存在糖基化修饰。综上,利用毕赤酵母X-33成功表达了HN蛋白,且纯化产物纯度较高、活性良好,具有糖基化修饰。     

华山新麦草α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达分析

 【研究目的】克隆华山新麦草（Psathyrostachys huashanica）的α-醇溶蛋白基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析,将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5克隆到表达载体pET-28a (+)上,获得重组质粒pET28a-Gli-Ns转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦草基因组DNA中克隆了4个α-醇溶蛋白基因：Gli-Ns-2 (FJ713595)、Gli-Ns-3 (GQ139525)、Gli-Ns-4 (GQ139526)和Gli-Ns-5 (GQ139527)。序列分析表明,4条序列具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特征,含有8个或9个半胱氨酸残基,序列FJ713595为假基因。利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核系统中特异性表达。Western-blot证实融合蛋白可成功表达。【结论】克隆了4个华山新麦草的α-醇溶蛋白基因序列,基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核表达系统中成功表达,为小麦品质改良提供了新的候选基因。     

重组鸭α-干扰素基因工程菌表达条件的研究

为了确定重组鸭α-干扰素(DuIFN-α)基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α的最佳表达条件,对影响原核表达的主要因素:IPTG浓度、诱导时期、收获时间、培养诱导温度、葡萄糖浓度及培养基进行了优化;并利用抗性筛选对表达质粒的稳定性进行了研究。结果显示,诱导基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α表达DuIFN-α的最佳条件为:以TB+5 g/L葡萄糖培养基37℃培养至菌体OD600=0.8~1.1时,加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L,30℃诱导培养4~5 h。在最佳表达条件下,DuIFN-α的相对含量为34.1%,总含量(终菌体浓度×相对含量)达79.9;各种优化条件对表达质粒的稳定性未见明显影响。     

睾丸酮丛毛单胞菌ATCC 11996类固醇脱氢酶3α-HSD的高效表达与纯化

利用分子克隆的方法扩增与克隆睾丸酮丛毛单胞菌ATCC 11996的3α-HSD基因,构建以pET-15b为载体的表达工程菌,IPTG诱导蛋白表达,通过优化表达菌的最佳表达条件得到最大表达量的目的蛋白.诱导后将工程菌裂解,通过硫酸铵沉淀,Ni-NTA亲和层析,分子筛分离进行纯化,并测定纯化后蛋白的酶活性.结果表明:1)克隆获得了睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因并实现了异源表达;2)工程菌的最佳表达条件为:37℃培养,0.6mmol/L IPTG诱导4h,培养基中Zn2+终浓度为0.1 mmol/L;3)表达工程菌裂解后用60％硫酸铵沉淀,亲和层析和分子筛分离后得到了纯度高达99％的目的蛋白,纯化后的蛋白保持酶活性.本试验成功克隆表达了睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因,建立了3α-HSD的高效表达与纯化方法,为相应抗体的制备与水资源中的类固醇激素检测方法的建立提供基础.     

β-伴大豆球蛋白α′-亚基的基因克隆及原核表达

为制备N-连接糖基缺失的重组β-伴大豆球蛋白α′-亚基,以‘鲁96150’大豆种子为原料提取总RNA,经RT-PCR一步法获得‘鲁96150’大豆的全长cDNA,采用自行设计的引物F1/F2扩增得到目的基因α′,与pGEM-T easy载体相连构建重组克隆载体pGEM-α′,经XhoⅠ/EcoRⅠ双酶切得到目的基因与载体pET-28a连接构建重组原核表达载体pET-28a-α′,将经菌落PCR、双酶切及测序鉴定正确的表达载体转入感受态细胞E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白α′-亚基。对重组α′-亚基的诱导表达条件进行筛选,发现在菌液OD600值为0.8、诱导温度30℃、IPTG浓度为0.2mmol/L的诱导条件下诱导9h后α′-亚基的表达量较高,重组α′-亚基的分子质量大小约为70ku;工程菌pET-28a-α′-BL21经超声破碎、离心后发现重组α′-亚基部分存在于上清液中,部分形成包涵体蛋白。重组α′-亚基的克隆及表达为β-伴大豆球蛋白结构及功能特性的研究奠定基础。     

拟南芥和小菜蛾相互作用的差异蛋白分析

以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和专食性害虫小菜蛾(Plutella xylostella)为研究系统,运用蛋白质组学方法分析了拟南芥在小菜蛾取食诱导条件下叶片蛋白的差异表达情况。结果表明:有52个蛋白点在小菜蛾取食诱导条件下发生显著变化,其中28个蛋白点表达量上调,24个蛋白点表达量下调。运用质谱技术对其中的部分差异蛋白进行了鉴定,发现富含甘氨酸的RNA结合蛋白,3-磷酸甘油醛脱氢酶,ATP合酶的α亚基和β亚基在植物诱导防御中具有重要的作用,为揭示植物在昆虫取食条件下的化学防御机制提供蛋白质水平方面的理论基础。     

重组植物硫化激动素PSK-α融合蛋白诱导表达条件的优化

植物硫化激动素(phytosulfokine-α,PSK-α)是植物体内一种小分子肽类生长调节因子,具有促进细胞增殖等多种生物活性。但由于其在植物体内的含量极低,难以满足PSK-α研究和应用的需要。笔者在前期构建PSK-α原核型表达载体的基础上,研究了影响融合蛋白表达的因素,优化了培养条件,并运用谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)亲和柱层析对融合蛋白进行了分离纯化。通过单因素和正交试验的结果表明:培养温度、诱导剂浓度、诱导剂加入时机和诱导时间均对融合蛋白的表达量和表达形式有很大影响;在诱导温度20℃,扩大培养150 min(菌液培养至OD600值约0.8止)后加入诱导剂1.0 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG),诱导培养时间8 h条件下,可以获得最多的可溶性融合蛋白GST-PSK-α表达量。     

花叶矮牵牛嵌合体再生体系的建立

以花叶矮牵牛为材料,研究了外植体、激素浓度、光照强度、叶片生理状态、暗培养时间等因素对诱导嵌合体不定芽的影响,建立了花叶矮牵牛嵌合体再生体系。结果表明:无菌苗在2000 lx光照条件下,置于MS 6-BA 0.2 mg/L培养基上,嵌合体诱导率最大达到90.2%;生理年龄为20 d的叶片,在MS 6-BA 0.4 mg/L IBA0.01 mg/L培养基中,嵌合体诱导率最大达到34.8%,暗培养会降低嵌合体的诱导率。     

PTD-FNK蛋白的原核表达及纯化鉴定

【目的】原核表达Bcl-xL蛋白的突变体PTD-FNK蛋白,为揭示PTD-FNK蛋白的抗凋亡机制及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用提供参考依据。【方法】根据FNK蛋白核苷酸序列设计两对突变引物,以pET-28a(+)-PTD-Bcl-xL质粒为模板,PCR扩增两段突变序列;回收PCR产物片段进行Dpn I消化,构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α,以IPTG诱导融合蛋白表达,探索IPTG诱导表达的适宜温度,最后以SDS-PAGE电泳和Western bloting对纯化蛋白进行鉴定。【结果】两个突变片段的PCR扩增产物大小分别为462和5616 bp,经Dpn I消化后进行重组反应,再转化至大肠杆菌DH5α能成功构建pET-28a(+)-PTD-FNK质粒。在30℃下以IPTG诱导7 h可获得可溶性的PTD-FNK蛋白,以NI-NTA Argrose纯化后的融合蛋白经Western blotting鉴定为PTD-FNK蛋白。【结论】通过调控IPTG诱导温度可成功以可溶性形式表达出PTD-FNK蛋白,且诱导时间短,无须复性,有利于蛋白纯化及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用。     

GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及纯化

优化GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中的表达条件,并对其表达产物进行纯化。通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件,SDS-PAGE电泳分析以确定GST-LRF融合蛋白表达的最佳条件。并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱和电洗脱法纯化目的蛋白。结果表明:重组质粒转化菌E.coliBL21(DE3)在37℃、0.1 mmol/L IPTG诱导5 h时,GST-LRF融合蛋白表达量最高,经电洗脱法纯化得到了GST-LRF融合蛋白。已确定GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌的最佳表达条件,并纯化得到目的蛋白,为进一步制备抗LRF的单克隆抗体及LRF功能的研究奠定了基础。     

人雌激素相关受体α配体结合域的原核表达载体构建·表达及鉴定

[目的]构建含人雌激素相关受体α配体结合域区段的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。[方法]用Trizol试剂提取人肺腺癌A549细胞总RNA,逆转录为cDNA;应用PCR扩增人EERα-LBD基因片段,插入表达载体pET-30a-c(+)中;转化大肠杆菌BL2 l(DE3)PLysS,经IPTG诱导后表达并鉴定。[结果]应用PCR方法扩增出约687 bp的基因片段,酶切、纯化、连接至载体后,经测序与GenBank中的一致,表达蛋白相对分子质量约32 kD,纯化后用生物大分子相互作用系统鉴定为目的蛋白。[结论]已成功获得人EERα-LBD融合蛋白,为进一步的研究和应用奠定了基础。     

鸡恒定链活性片段和NDVF蛋白表位嵌合体的构建与鉴定

[目的]为研究基于恒定链(Ii)分子片段的免疫载体提供试验材料。[方法]利用鸡恒定链的部分有免疫活性的片段作为免疫载体结构,构建含新城疫病毒F蛋白抗原片段的嵌合体。[结果]成功构建了Ii-key/F306、Ii-key/F306/AP、Cyt/Ii-key/F306和Cyt/Ii-key/F306/AP 4个嵌合体。重组质粒能被诱导表达相应蛋白分子,而且通过纯化获得95%高纯度。[结论]该试验中嵌合体的成功制备为动物免疫试验奠定了基础。     

缺氧诱导因子2α在大鼠早期妊娠中的表达与调节

利用原位杂交、免疫组织化学、Western blot以及荧光定量PCR等试验技术,研究HIF-2α基因在大鼠早期妊娠1～9 d、激素处理、人工诱导蜕膜化及体外诱导人子宫基质细胞蜕膜化模型中表达情况。妊娠1～5 d子宫基质细胞中低表达;妊娠第6天在围绕着床位点子宫基质细胞中HIF-2α表达升高;妊娠第7～9天HIF-2α蜕膜中表达逐渐增强;24 h雌激素和孕酮处理HIF-2α在子宫中表达无变化。HIF-2α在人工诱导蜕膜化子宫中高表达。在体外诱导人子宫内膜基质细胞蜕膜化模型中,HIF-2α随诱导天数增加表达升高。体内体外试验结果表明,HIF-2α可能在早期妊娠蜕膜化过程中发挥作用。     

猪CD8α分子胞外区基因片段的原核表达

采用PCR技术从pGEM-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α胞外区去信号肽基因片段,并构建原核表达载体pET-30a-pCD8α-ED,在不同IPTG浓度和时间下进行诱导表达.结果表明:SDS-PAGE表达出约25ku的融合蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,IPTG最佳诱导浓度为0.5mmoL·L-1,诱导6h时表达量达到峰值;Western-blot结果显示,在25ku左右出现杂交条带,表明表达的融合蛋白能被抗HIS标签的单克隆抗体识别,说明目的蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.