鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究

研究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础。采用生物信息学方法分析P5的理化性质;分子克隆构建P5表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化P5蛋白,并免疫小鼠制备P5抗血清;Western blotting检测抗血清特异性与效价,免疫酶联法模拟P5抗血清对嗜水气单胞菌的体外识别;P5抗血清被动免疫红鲫,攻毒以评价P5蛋白的免疫保护功能;Western blotting分析P5蛋白抵抗鱼血浆的杀菌作用。结果表明:P5蛋白在气单胞菌属间同源性较好,进化保守。成功克隆表达、纯化P5蛋白,其最佳表达条件为:诱导时菌液浓度OD_(600)=1.0,IPTG浓度0.5 mmol/L,32℃诱导8 h。Western blotting验证P5抗血清特异性较好,效价达到1∶1 600,ELISA显示P5抗血清与嗜水气单胞菌存在识别作用,表明P5蛋白具有较好的免疫原性与抗原性。被动免疫显示P5抗血清对红鲫的免疫保护率为显著性的56%,具有良好的免疫保护作用。Western blotting发现P5蛋白可通过表达下调有效抵抗鱼血浆的杀菌作用,表明其可能与细菌抗血浆杀菌有关。综上,嗜水气单胞菌外膜蛋白P5是一种保护性抗原,有望作为防治嗜水气单胞菌感染的疫苗候选成分。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因DNA疫苗载体的构建及分析

为构建嗜水气单胞菌的DNA疫苗载体,根据已发表的该菌外膜蛋白基因momp的核苷酸序列设计一对特异性引物,应用PCR技术,扩增到嗜水气单胞菌L316的主要外膜蛋白基因,并插入到真核表达载体pcDNA3上,构建成DNA疫苗,命名为pcDNA3-POMP。以纯化的原核表达蛋白GST-POMP免疫SD大鼠制备抗血清,用ELISA测定抗体效价达到1∶100 000以上;用pcDNA3-POMP质粒转染293细胞,转染48h后收集细胞,提取细胞的RNA进行RT-PCR,检测到外源基因的表达。至此,初步完成嗜水气单胞菌DNA疫苗表达载体的构建,为进一步疫苗免疫和效价的检测奠定基础。     

斑马鱼SAA蛋白原核表达、抗体制备及菌结合试验

通过构建斑马鱼(Danio rerio)SAA原核表达载体,在大肠杆菌(E.coli)TB1中诱导表达并纯化获得了斑马鱼SAA融合蛋白,将纯化的斑马鱼SAA蛋白免疫Balb/c小鼠,制备了特异性多克隆抗血清,并研究了斑马鱼SAA融合蛋白与细菌的结合能力及检测了抗体效价。结果表明,纯化的斑马鱼融合SAA蛋白能够与5种细菌直接结合,血清效价达到1∶2 000以上。     

斑马鱼一种母源凝集素基因zfol的原核表达和抗体制备分析

zfol是斑马鱼的一种母源凝集素基因。从斑马鱼胚胎中提取RNA,应用RT-PCR从斑马鱼中得到zfol的基因片段,重组入原核表达载体pEASY-E2中得到重组质粒,并测序鉴定其序列的正确性,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中诱导表达,并纯化蛋白,利用纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子,制备斑马鱼母源凝集素Zfol蛋白的多克隆抗体,利用Western-blot方法检测抗体特异性,得到特异的多克隆抗体,为进一步研究母源凝集素基因zfol的功能奠定了基础。     

嗜水气单胞菌与迟顿爱德华氏菌二联外膜蛋白的表达及其初步免疫原性

在构建鳗鲡病原性嗜水气单胞菌与爱德华氏菌二联外膜蛋白重组表达载体的基础上,采用不同的诱导剂(IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间和诱导时菌液浓度对重组表达载体的表达条件进行探讨。结果表明,不同诱导剂(IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间和诱导时菌液浓度对该载体的表达无明显影响。在菌液浓度D600nm=0.8时,采用0.25mmol/L的IPTG经16℃诱导培养过夜后表达。表达产物采用KTApurifier-100蛋白质纯化仪,结合His标签柱亲和层析后获得分子质量87.1ku的高纯度蛋白。蛋白经透析复性后免疫鳗鲡以初步研究其免疫原性。结果表明,免疫后第28天,重组蛋白不同剂量注射组的鳗鲡血清中抗体效价均显著高于PBS注射对照组,初步表明该重组表达蛋白具有良好的免疫原性。     

嗜水气单胞菌重组Aer毒素的纯化和抗原性分析

对原核表达的重组嗜水气单胞菌Aer毒素进行初步纯化,比较了它与天然Aer毒素的抗原性,为建立检测该毒素的免疫学方法奠定了基础。将原核表达的重组Aer毒素经SDS-PAGE后,切下目的蛋白,利用电洗脱法将蛋白洗脱出来,后经透析、PEG8000浓缩、定量,对獭兔进行免疫,采集血清,提纯IgG,在W estern b lotting试验中可与天然Aer毒素起反应,说明,体外表达的重组Aer毒素保留了天然Aer毒素所具有的抗原性。同时,将嗜水气单胞菌AHCS02菌接种于兔鲜血平板,30℃、培养15 h后,将具有β-溶血的单菌落于LB液体培养基中培养后,用饱和硫酸铵法提取上清液中的天然Aer毒素,用甲醛脱毒后,以同样免疫方法免疫獭兔,免疫结束后,采集血清提取IgG,在W estern b lotting试验中,可以检测到重组Aer毒素。试验说明:原核表达的重组Aer毒素和天然Aer毒素诱导獭兔产生的血清IgG抗体可以互相识别重组Aer毒素和天然Aer毒素,重组Aer毒素和天然Aer毒素有相似的抗原性。     

嗜水气单胞菌重组Aer毒素的纯化和抗原性分析*

 对原核表达的重组嗜水气单胞菌Aer毒素进行初步纯化,比较了它与天然Aer毒素的抗原性,为建立检测该毒素的免疫学方法奠定了基础。将原核表达的重组Aer毒素经SDS-PAGE后,切下目的蛋白,利用电洗脱法将蛋白洗脱出来,后经透析、PEG8000浓缩、定量,对獭兔进行免疫,采集血清,提纯IgG,在Western blotting试验中可与天然Aer毒素起反应,说明,体外表达的重组Aer毒素保留了天然Aer毒素所具有的抗原性。同时,将嗜水气单胞菌AHCS02菌接种于兔鲜血平板,30 ℃、培养 15 h 后,将具有β-溶血的单菌落于LB液体培养基中培养后,用饱和硫酸铵法提取上清液中的天然Aer毒素,用甲醛脱毒后,以同样免疫方法免疫獭兔,免疫结束后,采集血清提取IgG,在Western blotting试验中,可以检测到重组Aer毒素。试验说明：原核表达的重组Aer毒素和天然Aer毒素诱导獭兔产生的血清IgG抗体可以互相识别重组Aer毒素和天然Aer毒素,重组Aer毒素和天然Aer毒素有相似的抗原性。     

AmrB对嗜水气单胞菌氨基糖苷类抗生素耐药性的影响

AmrB是药物外排系统的重要成员,探讨AmrB与嗜水气单胞菌氨基糖苷类抗生素耐药性的关系,对研究嗜水气单胞菌耐药机制有重要意义。将amrB基因克隆至pET-28a载体上,双酶切和测序验证得到重组质粒amrB-pET-28a。对amrB-pET-28a/BL21进行诱导表达和镍柱纯化,制备得到效价为1∶6 400的兔抗AmrB抗血清。诱导获得嗜水气单胞菌AH1卡那霉素、链霉素和庆大霉素耐药菌株,Western blotting分析AmrB在耐药菌株中的表达量。Phoretix 1D和SPSS分析表明,AmrB的表达量在卡那霉素、链霉素和庆大霉素耐药菌株中显著地高于对照菌嗜水气单胞菌AH1,分别是对照的2.16、2.65和2.13倍,提示AmrB在嗜水气单胞菌对氨基糖苷类抗生素耐药过程中起重要作用,这将有助于了解嗜水气单胞菌耐药的分子机制。     

林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆及原核表达

以长白山林蛙中分离的嗜水气单胞菌为材料,对嗜水气单胞菌气溶素基因进行克隆、序列分析及基因表达等研究,为嗜水气单胞菌的分子生物学研究提供依据。通过实验成功克隆了气溶素基因,大小为1163bp,对其进行同源性检测,与基因库中DQ186611基因序列的同源性高达99%;构建原核表达重组质粒pGEX-Aer,在大肠杆菌BL21中获得表达,蛋白分子量约为69ku,以包涵体形式存在。     

嗜水气单胞菌菌蜕系统的构建及其免疫效果研究

【目的】探讨鱼源嗜水气单胞菌菌蜕系统的可行性和应用性。【方法】以PhiX174基因组DNA为模板,对LysisE基因进行PCR扩增,并将纯化的PCR产物与原核表达载体pBV220双酶切后连接,构建溶菌质粒pBV220-LysisE。将pBV220-LysisE转入嗜水气单胞菌LN0925株中,构建LN0925(pBV220-LysisE)菌蜕疫苗(AHGs),进而通过溶菌动力学过程检测、电镜下细菌形态观察和动物免疫保护试验等评价所制备的菌蜕疫苗。【结果】PCR扩增成功获得长度为276bp的噬菌体LysisE基因;成功构建pBV220-LysisE重组质粒及AHGs。在42℃诱导60min后,LN0925(pBV220-LysisE)菌株开始出现溶菌现象,至3h后溶菌基本结束;溶菌至210min时,其裂解效率达到99.99%。菌液浓度对菌蜕裂解效率的影响试验表明,不同浓度质粒pBV220-LysisE均可以高效诱导嗜水气单胞菌LN0925株裂解。电镜观察发现,AHGs形成明显的溶菌孔道,整体细胞形态完好,且内容物流失。动物免疫保护试验结果表明,AHGs疫苗能明显提高鲤鱼的血清抗体水平,在免疫后5-6周血清抗体凝集效价达到1∶256,从第7周开始呈下降趋势;AHGs和甲醛灭活疫苗(FKC)的相对保护率分别为77.78%和55.56%。【结论】AHGs能够有效激活鱼体的免疫系统并产生免疫保护,且较FKC具有更好的免疫保护效果。     

小鼠TRIM59蛋白多克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

【目的】制备兔抗鼠三结构域蛋白59(Tripartite motif-containing 59,TRIM59)多克隆抗体。【方法】利用PCR方法得到小鼠TRIM59基因片段,将其克隆至pGEX-2T原核表达载体中,转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达GST-TRIM59融合蛋白。GST-TRIM59融合蛋白经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA测定兔抗鼠TRIM59多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性。用免疫组织化学方法检测TRIM59在小鼠前列腺癌组织中的表达。【结果】成功构建了pGEX-2T-TRIM59原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-TRIM59融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体。ELISA测定结果表明,TRIM59多克隆抗体效价为1∶106以上;Western blot分析表明,TRIM59多克隆抗体具有良好的特异性。免疫组织化学检测发现,TRIM59在小鼠前列腺癌组织细胞中高表达。【结论】成功地制备了特异性良好的兔抗鼠TRIM59多克隆抗体,其具有良好的免疫学活性,能够用于相关研究。     

抗嗜水气单胞菌IgY的提纯及体外抑菌效果研究

以灭活嗜水气单胞菌(AS 1.927菌株)为抗原免疫蛋鸡,采用水稀释法粗提蛋黄液IgY和硫酸铵法纯化粗提物中IgY,研究其在上清液中的抗体提取率及其体外抑菌效果.研究表明,pH 5.0、10×水稀释法粗提后上清液中IgY抗体提取率为78.34%,33%(v/v)饱和硫酸铵法纯化后上清液中抗体提取率为64.1%,SDS-PAGE电泳显示纯化后的IgY纯度较高.pH 5.0、10×水稀释法粗提后的特异性IgY浓度达1.0 mg/mL时,嗜水气单胞菌在18 h内无生长.结果提示,用水稀释法和硫酸铵法提取蛋黄中的抗嗜水气单胞菌特异性IgY,具有简便、快捷、高效的特点,所制备的IgY活性较高,可用于嗜水气单胞菌感染引起的水生动物疾病预防和控制.     

迟钝爱德华氏菌外膜蛋白基因工程表达产物的免疫原性

构建迟钝爱德华氏菌外膜蛋白重组表达载体后,表达纯化获得分子质量约53ku的外膜蛋白。将100尾日本鳗鲡均分为2组,分别腹腔注射牛血清白蛋白(BSA,0.5mg/mL)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白(Omp,0.5mg/mL)0.2mL/尾。于免疫后第7、14和28天采集鳗鲡血液、粘液、肝脏和肾脏,测定各时间点的补体活性、溶菌酶活性、全血细胞转化水平和血清抗体效价。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡的补体活性于免疫后第7天极显著高于对照组;其抗体效价于第14天和第28天显著或极显著高于对照组。免疫后第28天以迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌(1.0×107 cfu)腹腔注射感染鳗鲡。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡对迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌的相对免疫保护率分别为71.4%、50.0%和12.5%。表明鳗鲡注射迟钝爱德华氏菌基因工程表达外膜后显著提高了其对迟钝爱德华氏菌感染的抵抗力,对嗜水气单胞菌的感染也有明显的交叉保护效果,但对创伤弧菌的交叉保护效果较弱。     

β-hemA-ISCOMs对鳗鲡的口服免疫效果

携带嗜水气单胞菌β-溶血素基因的重组菌可表达具天然活性的β-溶血素。重组菌胞外产物制成的ISCOMs(β-hemA-ISCOMs)经由肠胃途径免疫,可显著提高鳗鲡淋巴细胞的增殖转化能力(P<0.05),并诱导免疫保护,一次免疫的攻毒存活率为44.4%。二次免疫的攻毒存活率为100%。本研究首次将ISCOMs技术应用于鳗鲡口服免疫,试验结果表明ISCOMs技术在发展鱼类口服型疫苗上有广阔的应用前景。     

碳酸氢钠对嗜水气单胞菌致病性及其主要毒力相关基因表达的影响

为探讨碳酸氢钠对嗜水气单胞菌毒力基因表达的影响,利用荧光定量PCR技术,以未添加碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为对照组,添加0.024、0.048、0.072、0.096和0.120 mol/L碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为实验组,对嗜水气单胞菌的3个主要毒力基因——溶血素基因(AHH-1)、气溶素基因(Aer A)和弹性蛋白酶基因(ahyB)进行相对表达分析。结果表明,5个实验组嗜水气单胞菌的AHH-1、AerA和ahyB表达量均显著低于对照组。且随着碳酸氢钠浓度的增加,基因表达呈逐渐下调趋势。人工感染结果表明,添加碳酸氢钠培养的嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量明显比对照组高,而且随着碳酸氢钠浓度的增加,嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量呈现逐渐加大的趋势,表明毒力逐渐减小。     

5种中草药提取物对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果(摘要)(英文)

[目的]研究5种中草药提取物对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的体外抑菌效果。[方法]以鱼类常见病原菌嗜水气单胞菌为供试菌,测定了5种中草药对嗜水气单胞菌的体外抑菌作用,并测定了其中效果较好的中草药的治愈率,确定了其最佳用药剂量。[结果]在相同试验条件下,5种中草药中五倍子(Rhuschinensis Mill)、石榴皮(Punica granatum L.)和诃子(Terminalia chebula Retz)对嗜水气单胞菌有较强的抑菌效果,其中五倍子抑菌效果显著高于其他几种中草药(P0.05)。五倍子治疗由嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症的最佳治疗剂量为:0.5mg/ml五倍子药液药浴40min,治愈率为100%。[结论]该研究为鱼类暴发性细菌病的防治提供了科学的用药依据。     

猪鼻支原体3-磷酸甘油醛脱氢酶表达及黏附细胞功能研究

利用原核表达载体pET-28a(+)构建猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis, Mhr)的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)重组表达菌,研究GAPDH黏附宿主细胞的功能。结果表明:成功构建了表达rMhr-GAPDH的重组工程菌,利用IPTG诱导蛋白表达,镍柱亲和层析纯化,成功获得高纯度的rMhr-GAPDH重组蛋白。用重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,对Mhr液体培养物和固体菌落进行免疫杂交,均可检测到GAPDH,提示其可表达于菌体表面。将rMhr-GAPDH蛋白与人气道上皮细胞NCI-H292共孵育,利用间接免疫荧光试验可检测到黏附在细胞上的重组蛋白,利用微孔板黏附试验进一步证明rMhr-GAPDH蛋白与细胞膜蛋白的结合具有剂量依赖性,并可为其抗体所抑制。该研究构建表达和纯化了Mhr的GAPDH重组蛋白,检测到其在菌体表面的表达,并证明其具有黏附细胞能力,这有助于进一步研究Mhr黏附感染的致病机制。     

香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为筛选出抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物,以嗜水气单胞菌和香叶木素为研究对象,通过最小抑菌浓度测定、生长曲线、溶血试验、免疫印迹、荧光定量PCR和细胞毒性试验研究了香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用。结果发现,对嗜水气单胞菌生长没有影响的香叶木素能在较低浓度下通过抑制气溶素的表达降低共培养物上清液的溶血活性;荧光定量PCR试验发现香叶木素能剂量依赖性地降低气溶素编码基因aerA 的表达。此外,通过活/死细胞染色发现香叶木素可减轻气溶素介导的细胞损伤。以上结果表明,香叶木素通过降低aerA的转录水平降低了嗜水气单胞菌的体外致病力,可作为一种抗嗜水气单胞菌感染的候选药物。     

马腺疫链球菌GAPDH重组蛋白的表达及其免疫保护效果的研究

为制备马腺疫链球菌(Streptococcus equi subspecies equi)GAPDH蛋白的多克隆抗体,研究其免疫保护作用。以S.equi分离株为研究对象,利用PCR技术扩增其GAPDH基因并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌。诱导表达重组蛋白,对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting分析。以纯化后的GAPDH重组蛋白免疫小鼠,用酶联免疫吸附法、攻击保护试验检测其免疫效果。结果显示,成功构建了pET-28a-GAPDH原核表达载体,纯化获得30 kDa重组蛋白。该蛋白质能特异性识别该菌抗血清,诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,在初次免疫后第45天,抗体水平效价可达1∶24 300,攻击保护率可达87.5%。该GAPDH重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果。     

嗜水气单胞菌黏附素基因克隆、序列分析及表达

利用PCR方法对江浙一带淡水鱼类暴发病病原致病性嗜水气单胞菌主要血清型O:9和O:97代表菌株TPS-30和BSK-10的黏附素基因(Al)进行扩增,并分析不同血清型和不同来源菌株Al的序列差异.结果表明:嗜水气单胞菌TPS-30株与BSK-10株相比较,Al序列在N端有个突变区,TPS-30株的Al基因突变区较BSK-10株短;通过pET28a(+)载体构建TPS-30株黏附素基因的表达载体pET28a-AHal,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约41ku相吻合的融合蛋白带,诱导6h后目的蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的44.0%;通过免疫攻毒试验发现,免疫银鲫后血清效价在第5周达到峰值,重组表达的蛋白对同源菌株TPS-30和异源菌株BSK-10都具有较高的免疫保护率,分别达到94.7%和77.8%.这为基因工程亚单位疫苗的开发奠定了基础.