利用Red重组系统敲除大肠杆菌菌株ClpP基因方法的研究

为了研究ClpP基因的功能,试验利用Red系统的重组功能,通过PCR扩增出两端与大肠杆菌菌株ClpP基因上、下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段,电击转化含质粒pKD46的大肠杆菌菌株DH091,筛选替换ClpP基因的阳性转化子,再导入质粒pCP20去除氯霉素抗性基因。结果表明:成功敲除大肠杆菌菌株ClpP基因。     

猪传染性胸膜肺炎的诊断技术

猪传染性胸膜肺炎（PCP）,是一种高度传染性、致死性的呼吸系统传染病。该病的主要特征是急性与亚急性病例呈现纤维素性出血性胸膜肺炎、慢性病例呈现纤维素性坏死性胸膜肺炎。1957年,英国人Pattison等首次发现该病,目前已在世界各国广泛流行,造成巨大的经济损失,严重阻碍了世界养猪业的健康发展,     

牛分枝杆菌Spoligotyping和VNTR—MIRU的基因分型研究

为了探讨间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)和数目可变串联重复序列·结核分枝杆菌散在分布重复单元(VNTR-MIRU)基因分型法用于国内牛分枝杆菌的基因分型研究,初步了解我国牛分枝杆茵基因型种类、分布以及2种方法在我国应用的可行性.本研究收集东北、西北、华北、华南4个地区分离的10株牛分枝杆菌分离株,分别采用Spoligotyping和VNTR-MIRU对这些分离株进行基因分型,比较两种方法的分型效果,评价其在牛分枝杆茵基因分型中的应用.结果表明,使用Spoligotyping方法,10株牛分枝杆菌呈现出4种基因型,使用VNTR-MIRU方法,10株分离株也呈现4种基因型;当两种方法联合使用时,可以分为5种基因型,其中的2个茵株具有独特的基因型,显示来自不同地区的牛分枝杆菌存在主要的流行型为BCG家族.将Spoligotyping和VNTR-MIRU联合使用,可有效提高牛结核病的分子流行病学调查和病原学的监测效果.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组表达文库的构建及对小鼠的免疫保护作用研究

本研究应用限制性内切酶MboⅠ消化胸膜肺炎放线杆菌血清7型的基因组DNA，回收500bp～3000bp的片段，插入到真核表达载体pCDNA3．1（＋）的BamHⅠ酶切位点构建重组质粒，电转化大肠杆菌TG1，获得胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库（大约含有10^6个克隆）。将该文库随机分为10个亚文库（10个Clone pool），分别提取每个亚文库的重组质粒免疫小鼠（n=130只），免疫剂量为100μg，免疫3次后以1型胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒，通过相对保护率、肺组织荷菌数、病理组织学3个指标测定其对小鼠的免疫保护作用。试验结果表明，Clone pool3、Clone pool2、Clone pool6和Clone pool7的免疫效果明显优于其他免疫组，尤其是Clone pool3的免疫保护效果最佳。本研究成功构建了7型胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库，从而为筛选和获得新的保护性抗原基因奠定基础。     

牛结核病病原生态学和流行病学研究

牛结核病是严重危害牛和多种动物的人畜共患病,作者将从牛结核病的病原分类、动物感染谱、传播途径、地区分布和流行情况以及影响疾病的流行因素等方面进行综述,旨在为牛结核病的研究和防制提供参考.     

猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅳ A2．5kb基因片段的分子克隆及其表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内分离株72—1株基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出ApxⅣA基因2．5kb特异片段，将其克隆于pMD 18-T中，经酶切鉴定筛选重组质粒后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中登录的血清1型ApxⅣA(AⅪ302405)基因进行比较，结果显示核苷酸同源性为99．5％。将该片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的EfoRⅠ／SalⅠ位点，成功地构建了重组表达载体pGEX—apxⅣA，并转化大肠埃希氏菌BL2l，获得了表达。SDS-PAGE检测结果显示，表达的融合蛋白分子质量约为117ku，与预期片段大小相符；Western-blotting分析证实，该融合蛋白具有免疫学活性。     

重组ApxⅡA对胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗免疫效果的影响

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素的结构基因ApxⅡA克隆到原核表达载体pGEX-6P-1，并在大肠埃希氏菌中进行了表达，表达产物rApxⅡA以包涵体形式存在。为了检测rApxⅡA的免疫原性，分别用rApxⅡA、灭活疫苗以及灭活疫苗添加rApxⅡA对比利时白兔进行了免疫。免疫后进行攻毒，所用菌株分别为同型菌株（APP7型L25—4株）和异型菌株（APP1型4074株）。结果，免疫动物对相同血清型菌株的攻击获得完全保护，且对异型菌的攻击也获得一定保护作用。表明，rApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性，作为抗原成分添加到灭活疫苗中后可提高灭活疫苗的免疫效果。     

胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子的致病性及其免疫原性研究进展

猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌( Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的猪的呼吸道疾病.为了有效地控制本病,长期以来人们一直致力于研究高效、能提供强大保护力的疫苗,其中研究较多的是亚单位疫苗.人们发现把去除细胞的培养物上清液接种猪也可提供一定的保护力,于是对其中可能的毒力因子及具免疫原性的成分分别进行了分析.包括荚膜多糖、脂多糖内毒素、外膜蛋白、溶血素、转铁结合蛋白、蛋白酶以及所谓的渗透因子等.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌"菌影"的制备

本试验通过PCR扩增噬菌体PhiX174 的裂解基因E,将该基因连接到含有入PL/PR-cI857启动阻遏系统的pBV220 栽体中,从而使裂解基因E和启动阻遏系统入PL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建重组质粒pBV-E.再将含有E基因的裂解盒插入到App-E.coli穿梭载体pGZRS-18中,构建胸膜肺炎放线杆菌打孔质粒.采用电击穿孔法将其转入胸膜肺炎放线杆菌中,含有打孔质粒的胸膜肺炎放线杆菌在28℃条件下生长到对数生长期,升温42℃诱导E基因的表达,制备了胸膜肺炎放线杆菌菌影.电镜观察菌影形态完整,内容物全部被释放到胞外.本试验为进一步研究菌影这一新型菌苗及佐剂奠定了基础.     

胎儿弯杆菌表面蛋白(SapA)基因的分段表达及其免疫原性分析

应用PCR方法扩增出胎儿弯杆菌表面蛋白基因（SapA）的2个基因片段SapA-N（1398bp）和sapA—C（1422bp）,采用DNA重组技术,将2个基因片段分别连接于表达载体pET32a（＋）,并在大肠杆菌中诱导表达（rSapA—N和rSapA—C）,用金属鳌合层析的方法纯化蛋白。以Western blot检测重组蛋白的免疫学活性,ELISA试验分析2种蛋白用于胎儿弯杆菌病血清学诊断的可能性。结果表明,以可溶形式表达的2部分蛋白分子量大小约66ku,与预期大小相符。纯化的蛋白均具有良好的免疫学活性,但蛋白rSapA-N比蛋白rSapA-C的免疫学活性高,rSapA-N具有良好的胎儿弯杆菌病血清学诊断的应用价值。