副猪嗜血杆菌菌影的制备

为研制副猪嗜血杆菌(H.parasuis)菌影疫苗,本实验通过PCR扩增噬菌体PhiX174的裂解基因E,将其连接到含有λPL/PR-cI857启动阻遏系统的pBV220载体中,使裂解基因E与λPL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建重组质粒pBV-E。并将含有E基因的裂解盒插入pMD18-T载体中,构建H.parasuis打孔质粒(pMD-E)。采用电击穿孔法将其转入E.coliβ2155中,利用接合的方式将打孔质粒转入H.parasuis 5型菌株中。将含有打孔质粒的H.parasuis在28℃培养至对数生长期,升温到42℃诱导E基因表达,制备H.parasuis菌影。电镜观察菌影形态完整,内容物全部被释放到胞外。本实验为进一步研究菌影疫苗奠定了基础。     

致禽肾脏、肠道病变大肠杆菌菌影的制备及其裂解效率的测定

为制备高裂解效率的致禽肾脏、肠道病变大肠杆菌菌影,本研究通过编码15个柔性氨基酸linker采用融合PCR法将噬菌体中Φ174的裂解蛋白E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因(SN)串联(E-15L-SN),插入温控表达质粒pBV220,构建重组温控双裂解表达质粒(pBV-ES),采用PCR扩增其温控双基因裂解表达盒(DLS-ES)插入E.coli-Pasteurella(大肠杆菌和巴氏杆菌)穿梭质粒pBA1100,构建重组温控双基因裂解穿梭质粒pBA1100-DLS-ES。该质粒可以通过温控制备高裂解率的E.coli和Pasteurella两种菌的菌影。本实验将构建的pBA1100-DLS-ES电转化至致禽肾脏、肠道病变E.coli中,28℃集菌,42℃温控诱导裂解蛋白E和核酸酶A表达。OD_(600nm)值及电镜结果表明,双基因裂解率高于单基因,同时收集菌影时间也比单基因裂解短,42℃诱导2 h含双裂解基因的菌液处理菌体裂解率达到99.9999%,本实验利用菌影形成机制将含青霉素抗性的致禽肾脏、肠道病变E.coli制备成菌影,为新型菌影疫苗的制备提供实验依据。     

大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体构建

合成胸膜肺炎放线杆菌质粒pKMA2425上长度为126bp及2214bp的2个DNA片段,克隆到大肠埃希氏菌质粒pGSI中,获得重组质粒pGSIA。PCR扩增pTKRED上的大观霉素抗性基因及线性化的pGSIA（126bpDNA片段-pGSI-2214bpDNA片段）,连接,电转化胸膜肺炎放线杆菌,在大观霉素的选择压力下筛选鉴定到连接正确的质粒,命名为pGSIAS。pGSIAS测序结果符合预期。在大观霉素的选择压力下,含有pGSIAS的胸膜肺炎放线杆菌血清1-10型菌株均生长良好;在氨苄青霉素的选择压力下,含有pGSIAS的大肠埃希氏菌生长良好。结果表明本研究构建的大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体pGSIAS序列正确,在胸膜肺炎放线杆菌及大肠埃希氏菌中均能复制并表达质粒上的相关基因。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型信号标签诱导突变体库的构建

本研究以自杀性质粒pUT携带含有信号标签的Mini-Tn5转座子对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌进行转座诱变,构建了带有12对特异性信号标签的Mini-Tn5转座子的pUT自杀质粒,转化到供体菌E.coliβ2155后,利用双亲本滤膜杂交法与受体猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌(APP1)进行接合转移,构建并优化了接合转移体系.利用抗性和营养缺陷培养平板筛选得到接合突变体,通过抗性通用引物与12个特异标签引物和胸膜肺炎放线杆菌毒素IV(ApxIV)鉴定引物分别对这些突变体进行了PCR鉴定和测序验证.结果表明,经过加入标签的MinI-Tn5转座子可以通过接合转移的方式从供体菌E.COliβ2155中插入到APP1基因组当中,并成功构建了12个含有特异信号标签的重组质粒,获得了APP1的12个转座突变体库,经筛选鉴定后得到561个突变株.这为研究APP1的功能基因和筛选特定突变株提供了必要的基础.     

犬布鲁氏菌菌壳疫苗的制备简

菌壳技术是一种新型的灭活疫苗制备方法,通过非变性的灭活方式保存细菌表面多个抗原表位,所制备的菌壳可作为预防细菌病的理想疫苗。本试验从噬菌体PhiX174 DNA钓取裂解E基因,连接至温控原核表达载体pBV220,通过PCR在所构建的pBV220+E上扩增出蛋白裂解部件（protein lysis component,PLC）,该部件包含阻遏蛋白cI857、溶菌E基因及终止序列rrnbT1T2,然后将其克隆至广宿主表达载体pBBR1MCS-2中,最终将构建的广宿主裂解质粒pBBR+PLC电转入犬布鲁氏菌RM6/66中。试验结果表明,经42 ℃诱导后,广宿主裂解质粒对犬布鲁氏菌RM6/66的裂解率达100%,成功制备了犬布鲁氏菌RM6/66菌壳疫苗。本试验通过菌壳技术制备的犬布鲁氏菌疫苗对预防宠物犬布鲁氏菌病起到重要作用,同时也对人兽布鲁氏菌疫苗的研制提供新策略。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxIA在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

以胸膜肺炎放线杆菌1型参考菌株App-259株基因组DNA为模板,PCR扩增apxIA全基因,构建表达重组质粒apxIA-c2X,并将其转化至大肠杆菌TB1,SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物.结果表明:成功构建了apxIA-C2x表达质粒,重组菌在15℃经0.2mmol/L IPTG诱导16 h获...     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组表达文库的构建及对小鼠的免疫保护作用研究

本研究应用限制性内切酶MboⅠ消化胸膜肺炎放线杆菌血清7型的基因组DNA，回收500bp～3000bp的片段，插入到真核表达载体pCDNA3．1（＋）的BamHⅠ酶切位点构建重组质粒，电转化大肠杆菌TG1，获得胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库（大约含有10^6个克隆）。将该文库随机分为10个亚文库（10个Clone pool），分别提取每个亚文库的重组质粒免疫小鼠（n=130只），免疫剂量为100μg，免疫3次后以1型胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒，通过相对保护率、肺组织荷菌数、病理组织学3个指标测定其对小鼠的免疫保护作用。试验结果表明，Clone pool3、Clone pool2、Clone pool6和Clone pool7的免疫效果明显优于其他免疫组，尤其是Clone pool3的免疫保护效果最佳。本研究成功构建了7型胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库，从而为筛选和获得新的保护性抗原基因奠定基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxⅡCA基因的克隆和基因缺失

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxIICA基因用特异性引物进行PCR扩增并克隆到T载体上,构建重组质粒pMD18-ApxIICA,将pMD18-ApxIICA转化到E.coli JM83中并测序.序列分析表明血清型7型25-4株ApxII CA与其它血清型(5型和9型)核苷酸序列同源性达98%以上,氨基酸序列同源性达90%以上.利用ApxIIC基因内部单一的SpeI位点,设计特异性的引物,利用PCR技术在ApxIIC基因内部缺失165bp的核苷酸片段,PCR产物再用SpeI进行酶切,并体外连接构建得到含有ApxIIC缺失基因的重组质粒pMD18-ApxII△/CA.     

猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白基因的克隆与表达

研究通过筛选猪胸膜肺炎放线杆菌3～8 kb随机基因组文库获得1株阳性克隆.测序拯救质粒得到序列,通过BLAST分析确定此片段为猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白基因,预计成熟蛋白分子质量为45.716 ku.根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该Ⅱ型分泌蛋白.Western-blot结果表明,该蛋白能与猪胸膜肺炎放线杆菌康复期血清发生反应.