靶向口蹄疫病毒IRES区RNA干扰位点的选择及shRNA表达载体的构建与鉴定

以口蹄疫病毒WFL株为试验株,对口蹄疫病毒的IRES序列进行了保守性分析和RNA二级结构预测,推测高度保守的FMDV复制原点区域位于容易被siRNA结合的IRESRNA二级结构的环区,因此,在该区选择确定了2个siRNA干扰靶位,设计并合成能表达其小发夹结构shRNA的表达模板,克隆到含有U6启动子的真核表达载体中,建立了靶向口蹄疫病毒IRES区的siRNA真核表达系统,为进一步研究针对该区的RNA干扰对口蹄疫病毒的抑制作用打下了基础。     

布鲁氏菌LPS单克隆抗体修饰的纳米颗粒制备及电镜观察

为了研究新型纳米材料在免疫电镜技术及病原超微结构观察、定位等方面的应用,试验用羧基量子点微球、时间分辨荧光微球、胶体金颗粒3种纳米材料对布鲁氏菌LPS单克隆抗体进行标记,再与布鲁氏菌病试管凝集试验抗原结合成抗原-抗体免疫复合物,并用电镜观察标记结合效果.结果 表明:在电镜下,可观察到布鲁氏菌病试管凝集试验抗原以聚集或单...     

羊布鲁菌强毒株16M与疫苗株M5外膜蛋白蛋白质组学研究

通过比较蛋白质组学分析M5生存表型的改变所引起的蛋白图谱与强毒株的差异之处,根据这些差异表达蛋白的LC/MS-MS鉴定结果来分析疫苗株的致弱机制进而为寻找新的毒力相关分子、鉴别诊断分子以及揭示布鲁菌胞内寄生机制提供帮助。本研究利用比较蛋白质组学技术,对布鲁菌强毒株16 M和弱毒株M5的外膜蛋白进行了差异比较分析,结果共发现33个差异蛋白点,代表了26个开放阅读框,这些蛋白涉及了蛋白质的生物合成(5/26)、氨基酸合成(3/26),脂肪酸代谢(2/26)、能量代谢(5/26),以及细胞被膜生物合成(4/26)和一些调节系统(4/26)等多个生物过程。这些发现为研究外膜蛋白在布鲁菌毒力,胞内寄生等过程中发挥的重要作用提供了新依据。     

口蹄疫病毒2B基因的生物信息学分析及其siRNA真核表达系统的建立

应用RT-PCR方法扩增口蹄疫WLF株2B基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测序后进行序列保守性分析和RNA二级结构分析,筛选适合作为siRNA的靶序列。根据siRNA表达载体要求,合成shRNA表达模板,连接到含有U6启动子的真核表达载体中,建立了靶向口蹄疫2B基因的真核表达系统,为进一步研究靶向2B基因的RNA干扰对口蹄疫病毒的抑制作用奠定了基础。     

丹顶鹤大肠杆菌病的诊治

通过对某动物园6只发病死亡的丹顶鹤进行剖检，见3例呈纤维性心包炎变化，肝脏肿大且质地脆弱，脾有针尖大的出血点，取心、肝、脾等进行涂片，革兰氏染色，镜检，在各组织 均可见两端钝圆的革兰氏阴性杆菌。取心、肝、脾等脏器进行石蜡包埋，切片，HE染色，镜检。主要病理组织学变化为：心外膜增厚，有大量纤维蛋白及异嗜性白细胞，巨噬细胞浸润，部分心肌细胞，肝细胞，脾细胞发生凝固性坏死。取其肝，脾作电镜负染，未发现病毒颗粒。综合流行病学，病原学检查及病理变化等，可确诊为大肠杆菌感染。     

口蹄疫病毒对树突状细胞感染能力的研究

树突状细胞（dendritic cell,DC）是重要的抗原递呈细胞,本研究发现通过口蹄疫病毒（foot and mouth diseasevir US,FMDV）感染DC细胞后可以有效感染小鼠骨髓来源DC,而且在感染后48h,FMDV对未成熟DC（imDC）的感染能力稍高于成熟DC（mDC）.     

羊布鲁氏菌强毒株16M感染小鼠巨噬细胞模型的建立

巨噬细胞是机体抗吞噬能力最强的细胞,但布鲁氏菌不但不能被巨噬细胞杀死,反而能在胞内大量繁殖,因此,本研究建立其感染模型,为下一步继续研究布鲁氏菌与其宿主细胞表面相关膜蛋白之间的作用和胞内寄生机制奠定基础。用羊布鲁氏菌强毒株16M感染巨噬细胞系264.7（细胞和细菌比例为1∶500）,感染时间为4 h,建立布鲁氏菌感染巨噬细胞模型,做间接免疫荧光试验和透射电镜试验。间接免疫荧光试验中一抗与二抗最佳稀释度分别为1∶80和1∶80,电镜下观察到细菌侵入细胞时膜凹陷,形态发生变化,形成内吞小体。本试验减少感染过程所涉及的环境因素,优化了间接免疫荧光试验所需的一抗和二抗浓度比,成功建立感染模型。     

鉴别布鲁菌病自然感染动物与疫苗免疫动物胶体金检测试纸条的研制

用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）标记胶体金技术制作金标垫,以亲和层析法纯化的BP26蛋白作为检测抗原（T线）,研制胶体金快速检测试纸条。用建立的试纸条检测小鼠布鲁菌感染血清,可成功鉴别牛布鲁菌S19感染和BP26缺失疫苗株YZ-2免疫的小鼠。试纸条检测与布鲁菌属同源性较近的几株细菌的阳性血清,结果无交叉反应;试纸条敏感性高于虎红平板凝集试验检测方法,近似于ELISA方法;准确性同于ELISA法,且更为简便快捷。该试纸条具有鉴别布鲁菌病自然感染和疫苗免疫的应用前景。     

牛布鲁氏菌膜蛋白的免疫抗原筛选

试验旨在通过免疫蛋白质组学筛选布鲁氏菌保护性抗原。利用双向电泳技术对试验条件下培养的布鲁氏菌强毒株544A膜蛋白进行分离,结合Western blotting技术分别用豚鼠、牛抗布鲁氏菌血清寻找发生免疫反应的蛋白质。16个免疫蛋白点经胶内酶切、质谱(LC-MS/MS)进行鉴定。利用生物信息学工具发现这些蛋白不全是膜蛋白,还存在胞质蛋白,其功能涉及生物合成和物质代谢等领域。成功建立了布鲁氏菌膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,为寻找保护性抗原及为新型疫苗抗原候选提供新思路。     

猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A经NF-κB/MAPK通路对巨噬细胞RAW264.7影响的研究

通过猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A(catabolite control protein A,ccpA)原核表达蛋白对巨噬细胞RAW264.7进行刺激,结果发现,猪链球菌2型ccpA蛋白可以调节巨噬细胞NO产生,另外该蛋白质可通过对iNOS、NF-κB、p38 和 ERK 1/2 MAPK等的调节,从而影响巨噬细胞RAW264.7对细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌。该研究为类似蛋白质对免疫细胞NF-κB/MAPK等通路调节影响及细胞因子产生条件探索建立了基础。