猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxⅡCA基因的克隆和基因缺失

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxIICA基因用特异性引物进行PCR扩增并克隆到T载体上,构建重组质粒pMD18-ApxIICA,将pMD18-ApxIICA转化到E.coli JM83中并测序.序列分析表明血清型7型25-4株ApxII CA与其它血清型(5型和9型)核苷酸序列同源性达98%以上,氨基酸序列同源性达90%以上.利用ApxIIC基因内部单一的SpeI位点,设计特异性的引物,利用PCR技术在ApxIIC基因内部缺失165bp的核苷酸片段,PCR产物再用SpeI进行酶切,并体外连接构建得到含有ApxIIC缺失基因的重组质粒pMD18-ApxII△/CA.     

猪传染性胸膜肺炎及其综合防制

猪传染性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放线杆菌引起猪的一种高度接触传染性、致死性呼吸道传染病。本病病原为胸膜肺炎放线杆菌(APP)。     

牛分支杆菌热休克蛋白65基因的分子克隆和表达

以牛型分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增热休克蛋白65(Hsp65)基因,PCR产物经纯化与EcoRⅠ/SaⅠ双酶切后与经同样处理的原核表达载体pGEX-6P-1进行连接,转化感受态细胞BL21中,筛选和构建了原核重组表达质粒pGEX-H65,核苷酸序列测定验证其正确性.以1 Mol/LIPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,Hsp65基因表达的融合蛋白GST-H65裂解为两部分;即64 kD和22 kD,两个蛋白分子量相加与预测的86 kD(HsP60 kD GST26 kD)相符.牛分支杆菌热休克蛋白HSP65的成功表达为其功能的研究打下基础.     

金色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和副溶血弧菌单管多重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究根据金黄色葡萄球菌（Staphylococcus auretls，SA）耐热核酸酶（nut）基因、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi，ST）鞭毛抗原（H1-d）基因和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）热稳定直接溶血素（tdh）基因，分别设计了三对引物Nuc-F／Nu-R、H1-d—F／H1-d—R和Tdh-F／Tdh-R，预计PCR扩增的DNA片断分别为279bp、202bp和458bp。通过对单个基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、退火温度和dNTP浓度等的优化，建立了快速检测金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和副溶血弧菌的单管多重PCR方法，该方法检测的敏感性分别为：47．8PgST的基因组DNA．22．7PgSA的基因组DNA和0．3745PgVP的基因组DNA。模拟试验显示最低检测限度为分别为：SA150CFU／反应体系，ST98CFU／反应体系，VP53CFU／反应体系。表明该方法具有很好的应用价值和开发前景。     

牛分枝杆菌融合基因hsp65-esat6的原核表达及产物的纯化

以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板扩增hsp65和esat6基因。采用重叠延伸剪接技术（SOE）获得了融合基因hsp65-esat6，将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a（＋）上，构建重组质粒pET65-E6，将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，以IPTG诱导（终浓度为1mmol／L），表达产物进行SDS—PAGE分析。以Ni^2＋亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western—blot分析该融合蛋白的免疫活性。结果表明：Hsp65-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达。表达的融合蛋白裂解为两部分，即58ku和30ku，二者相加与预测大小88ku相符。纯化的融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

浙江省召开第二次全省灌区配套与渠道防渗经验交流会

为进一步贯彻落实全国农村水利工作座谈会精神,发展农村水利为农业增添后劲,浙江省水利厅和浙江省水利学会于1988年2月3～5日在义乌县召开了第二次全省灌区配套与渠道防渗经验交流会。会议交流了几年来全省进行灌区配套和渠道防渗工作的经验,参观了近年来为适应农村改革利用新技术不断完善灌区配套和渠道防渗的义乌县巧溪水库灌区。代表们一致认为,在当前农村深化改革的形势下,巧溪水库采用各种量水设施和各种建筑物,不断完善濯区配套,实现了按方收费和先收费后放水的供水制度;同时     

猪肾上皮细胞(PK-15)酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

应用SMART技术构建猪肾上皮细胞(PK-15)酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选与副猪嗜血杆菌(HPS)细胞致死膨胀毒素(CDT)不同亚基蛋白相互作用蛋白奠定基础。提取PK-15的总RNA,经LD-PCR合成双链cDNA,运用SMART技术,再通过同源重组的方法,构建了PK-15细胞的酵母cDNA文库。经检测,文库滴度达到了2.8×108CFU·mL-1,插入的双链cDNA片段范围为300～1 000 bp,片段平均大小为500 bp。此文库可用于筛选与HPS CDT不同亚基蛋白相互作用的蛋白,这将为治疗靶点的选择、基因缺失弱毒活疫苗的设计提供科学依据。     

猪传染性胸膜肺炎的诊断技术

猪传染性胸膜肺炎（PCP）,是一种高度传染性、致死性的呼吸系统传染病。该病的主要特征是急性与亚急性病例呈现纤维素性出血性胸膜肺炎、慢性病例呈现纤维素性坏死性胸膜肺炎。1957年,英国人Pattison等首次发现该病,目前已在世界各国广泛流行,造成巨大的经济损失,严重阻碍了世界养猪业的健康发展,     

猪附红细胞体PCR检测方法的建立

 根据已发表的部分猪附红细胞体序列设计了一对特异性引物，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增出了一条约936 bp的基因片段，并成功地将该基因克隆于克隆载体PMD18-T，经酶切分析和PCR进一步鉴定后进行序列测定，结果表明，所克隆的目的基因与GenBank中发表的序列一致。并利用特异性引物初步建立了猪附红细胞体病PCR检测技术。     

猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗在小鼠体内的免疫机制及其保护效力

 【目的】欲构建具有较好交叉免疫保护效果的多组分重组亚单位疫苗，从而为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。【方法】 利用分子克隆和重组表达技术获得了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌6种主要毒力因子rApxI、rApxII、rApxIII、rApxIV、rApfa和rOMP。并设立以灭活苗（5×108cfu）为试验I组，以重组蛋白rApxI、rApxII、rApxIII和rOMP为试验II组，以rApxI、rApxII、rApxIII、rApxIV、rApfa和rOMP为试验III组，以PBS为空白对照组。分3次免疫BALB/c小鼠，每次间隔2周，第3次免疫后的第7天以APP1型（5×109cfu）和APP2型（5×1010cfu）进行攻毒保护试验。【结果】试验II组的4种抗体水平（ApxI、ApxII、ApxIII和OMP）和脾淋巴细胞诱生IL-2水平显著高于其它3组(P<0.05)，脾淋巴细胞增殖水平也一直高于其它3组(P>0.05)。且试验II组对APP1型保护作用（9/10）明显高于试验I组（6/10）、试验III组(5/10)和对照组（0/10），而对APP2型保护作用（无肺脏损伤）也明显优于其它3组（典型肺部损伤），显示出细胞免疫和体液免疫水平与免疫攻毒保护之间存在着正相关性。【结论】试验II组通过激活体液免疫和细胞免疫，对不同血清型APP的攻击提供了很好的交叉保护作用。