禽白血病A亚群病毒引起的淋巴细胞性白血病诊断

采用病理组织学方法和分子生物学技术对某肉种鸡场的感染鸡进行实验室诊断,在肿胀的肝、肾和法氏囊组织切片中观察到成淋巴细胞增生病变。针对禽白血病病毒(ALV)群特异性抗原P27基因进行RT-PCR扩增,肾、肺、肝、脾病料样本中ALV病原核酸的检出率分别为100%、100%、90%和50%。将扩增的目的基因序列与GenBank公布的ALV参考毒株相应序列进行比较,核苷酸序列的同源性达到93.6%~97.7%。取ALV囊膜糖蛋白gp85基因的扩增产物进行酶切分析,扩增的目的片断中存在BglⅡ和SspⅠ酶切位点,BamHⅠ不能切割PCR产物。试验结果证实本次疫病是由ALV-A亚群病毒引起的淋巴细胞性白血病。     

接种鸡IBD弱毒疫苗后鸡脾脏TLR7基因表达的动态变化

给11日龄雏鸡分别口服接种鸡传染性腔上囊炎(IBD)弱毒疫苗(法贝灵,IBD-Blen)1头份和3头份后,于不同时间采集脾脏组织分离纯化淋巴细胞,用常规法抽提总RNA,以鸡β-actin基因为内参,采用半定量RT-PCR法检测脾脏组织中鸡Toll样受体7(chTLR7)基因的表达动态.结果表明:接种IBD弱毒疫苗前,试验鸡脾组织中chTLR7有微量表达;疫苗接种后,脾脏中chTLR7 mRNA的表达开始显著上升;接种后12小时达峰值,此后迅速下降;130小时降至疫苗接种前的基础水平.说明chTLR7可能参与了IBDV感染早期的天然免疫反应过程.     

Ghrelin对莎能奶山羊垂体催乳素和生长激素mRNA表达的影响

垂体催乳素和生长激素对雌性哺乳动物泌乳的启动和维持以及乳腺的发育都发挥着重要的调节作用.为探讨ghrelin对奶畜泌乳的调节作用,10只泌乳期莎能奶山羊随机分为2组(试验组和对照组),每组5只.试验组羊静脉注射ghrelin(3.0μg/kg)3 h后检测垂体催乳素(Prolactin,PRL)和生长激素(Grouth hormone,GH)mRNA的表达,结果显示一定剂量的ghrelin对催乳素mRNA的表达具显著上调作用(P<0.01);对生长激素mRNA的表达也有显著促进作用(P<0.01).结果表明,ghrelin在垂体水平上对催乳素和生长激素mRNA的表达具有上调作用,提示ghrelin可能通过对这些激素的作用参与了对奶畜泌乳的调节.     

广东地区鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及双重PCR检测方法的建立

对来自广东地区疑似鸭疫里默氏杆菌病的病鸭组织进行了病原菌的分离培养和生化鉴定,确定得到20株鸭疫里默氏杆菌,动物回归试验结果表明,分离的鸭疫里默氏杆菌具有很强的致病性.对这20株鸭疫里默氏杆菌进行的药敏试验表明,分离株已广泛产生耐药性.参照已经发表的2对引物以细菌全菌体为模板建立双重PCR方法,结果均能扩增出2条目的片段,经测序证实为鸭疫里默氏杆菌,而对鸭源大肠杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门菌和鸭源葡萄球菌的扩增结果均为阴性.说明建立的双重PCR方法能快速、准确的检测出鸭疫里默氏杆菌,并具有高度特异性,可用于鸭疫里默氏杆菌的快速鉴定和快速诊断.     

犬瘟热RT-PCR快速诊断方法的建立

本研究建立了快速诊断犬瘟热感染的RT-PCR方法,并应用该方法对犬瘟热病死犬的脏器及感染犬体表采集样品进行了检测。为确定犬瘟热最佳的隔离检疫周期及采样部位,本研究对一例CDV攻毒犬感染病程收集的口鼻液、粪便、尿液样品进行了对比检测,结果证实粪便、口鼻液等易于获取的样品中CDV病毒滴度较高,并可在发病全程检测到,因此,它们可作为理想的受试样品。     

进境种猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测

采用ELISA方法对812头份进境种猪血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体检测,结果发现编号213的血清呈阳性反应,其余呈阴性反应。对213号血样进行实时荧光RT-PCR扩增和凝胶RT-PCR扩增,结果显示荧光RT-PCR扩增呈阳性,凝胶RT-PCR扩增获得374 bp大小特异性片段,与已知的美洲株片段大小相符。该研究建立的先采用ELISA法检测血样,对可疑或阳性样本提取总RNA后进行荧光RT-PCR和凝胶RT-PCR的检疫模式,为PRRSV的快速检测和鉴定提供了新的技术手段,可满足大批量进境种猪快速检疫的需要,同时,该模式的建立,也为其他疫病的检疫提供了借鉴。     

牛冠状病毒和轮状病毒的双重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速诊断牛病毒性腹泻疾病的方法,利用本研究室分离鉴定的牛冠状病毒(BCV)和牛轮状病毒(BRV)毒株,根据GenBank中登录的BCV、BRV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增BCV、BRV的引物,经过条件优化,建立了检测BCV、BRV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为244 bp和382 bp.该方法检测BCV和BRV的敏感度分别为1个和100个TCID50/100μL.应用这一方法能从病料中检测出这2种病毒.结果表明该双重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于这2种病毒性疾病的快速诊断.     

鸡γ-干扰素cDNA的克隆和在大肠杆菌中的温度诱导型表达

克隆了鸡(Gallus gallus)的γ-干扰素cDNA，并用大肠杆菌(Escherichia coli)进行了温度诱导型表达。用PCR方法扩增了鸡γ-干扰素基因组基因，将其克隆到载体pGEM-T上。对重组载体的插入片段进行酶切分析和部分序列测定：证明了基因的正确性；克隆的鸡γ-干扰素基因的编码序列中存在一个点突变(G→A)，这一突变导致一个三联体密码子GAA变为AAA，编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys)。用鸡γ-干扰素基因组基因构建了真核表达载体pCI-ChIFN。将这一真核表达载体转染兔成纤维细胞的细胞系中进行表达实验：提取转染后细胞裂解物中的RNA，再以此为模板进行RT—PCR，获得了完整的鸡γ-干扰素cDNA基因，同时证明鸡γ-干扰素基因组基因能在兔成纤维细胞系中表达。用鸡γ-干扰素cDNA构建了温度诱导型原核表达载体pBVcDNA，并将其转导到大肠杆菌DH5α中，经细菌发酵和温度诱导，表达了一个18kD的特异蛋白，其表达量占细菌总蛋白的8．75％。     

中国人白细胞介素-12 (hIL-12)cDNA克隆及序列分析

根据已发表的IL-12两个亚基P35 cDNA序列（NM-000882）与P40 cDNA序列（NM-002187）设计2对引物。以LPS刺激的人脐血淋巴细胞为材料，采用RT-PCR技术从总RNA扩增hIL-12基因，包括完整的前体蛋白编码序列。所得到的序列与GenBank中发表的一致，但与CLMF和NKSF序列有所差异。P35同CLMF相比，244aa密码子GAC（Asp）→GAT（Asp）、247aa密码子ACG（Thr）→ATG（Met）；与NKSF比较，44aa密码子GTC（Val）→GTG（Val）。P40同NKSF比较239aa密码子AAC（Asn）→AAG（Lys），291aa密码子ACC（Thr）→ACG（Thr）；P40同CLMF相比较，氨基酸与核苷酸序列完全一致。通过与不同物种氨基酸及核苷酸序列比较分析，P40亚基与其它动物的同源性80％以上，P35亚基与其它动物同源性在70％。     

鉴别H5亚型两种分支禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为准确区分H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支的毒株,通过对GenBank和GISAID数据库中发表的以及本实验室保存的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行比对,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H5亚型禽流感病毒不同分支毒株的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化,同时开展了特异性和敏感性试验,以及临床应用检测。结果显示:该方法具有良好的特异性,与其他亚型禽流感病毒及常见禽病病毒无交叉反应;对H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支毒株的检测灵敏度分别为495.0 copies/μL和22.3 copies/μL;100份临床家禽拭子禽流感病毒检测结果与常规RT-PCR和病毒分离检测结果一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异、敏感、准确、耗时少,同时还可区分不同分支,可应用于H5亚型禽流感病毒的准确、快速检测。