犬瘟热RT-POR快速诊断方法的建立

本研究建立了快速诊断犬瘟热感染的RT-PCR方法，并应用该方法对犬瘟热病死犬的脏器及感染犬体表采集样品进行了检测。为确定犬瘟热最佳的隔离检疫周期及采样部位，本研究对一例CDV攻毒犬感染病程收集的口鼻液、粪便、尿液样品进行了对比检测，结果证实粪便、口鼻液等易于获取的样品中CDV病毒滴度较高，并可在发病全程检测到，因此，它们可作为理想的受试样品。     

犬瘟热病毒自然感染宠物犬不同部位检出率的分析

本试验利用RT-PCR检测方法对犬瘟热病毒(CDV)自然感染宠物犬的不同部位样品进行检测,确定CDV在感染犬组织中的分布情况。对14只CDV阳性犬的血液、眼分泌物、鼻液、唾液、粪便和尿液进行检测,RT-PCR方法检出的阳性率分别为92.9%、85.7%、100%、85.7%、100%和66.7%,结果显示粪便和鼻液样品的检出率最高,检出率达100%,宜于作为检测对象取材。     

荧光抗体技术诊断犬瘟热的研究

本研究建立了用于检测犬瘟热病毒的间接荧光抗体染色法。试验确定了1:80稀释的抗犬瘟热单克隆抗体和1:32倍稀释的荧光素标记羊抗鼠IgG为适宜的工作浓度。采用该方法检测21只犬瘟热自然感染犬的血液样品，CDV检出率为76％。对3只犬细小病毒自然感染犬，6只健康犬进行检测，各有一例为CDV抗原阳性。此外，用该方法检测了此21只犬瘟热病犬的眼分泌物、鼻汁、粪便和血涂片，其检出率分别为21％、14％、15％和76％。该方法与临床诊断的符合率为77％。另外，对稀释荧光素标记抗体冷冻保存，测定其保存期至少为7个月，染色后荧光稳定性为2周。该方法是一种简便、快速、特异的检测犬瘟热的方法，适于推广使用。     

荧光定量RT-PCR法对犬瘟热病毒PS株感染犬血清和粪便中病毒的检测

为研究犬人工感染犬瘟热病毒(CDV)后病毒在血清和粪便中的含量及变化,本实验根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列设计一对特异引物,扩增NP基因.并以NP基因重组质粒作为阳性标准品,建立检测CDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法.结果表明,该方法102拷贝～109拷贝范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.998,扩增效率为E=98.3％,敏感度高,最低检测限为6.1拷贝/μL,重复性检测变异系数低于2.62％.该方法与常规RT-PCR方法比较,其敏感性提高102倍.两只人工感染CDV PS强毒株的犬,分别于接种后17d、19d发病死亡,采用荧光定量RT-PCR方法对人工感染犬的血液和拭子液中的病毒核酸栽量进行定量检测以及对收集的22份临床样本拭子液进行检测,均检测到CDV.本研究结果表明,该方法可以用于CDV核酸定量检测,为该病毒的致病机理及病毒传播途径的研究提供了一种快速和敏感的检测手段.     

CDV、CPV和CPIV多重PCR检测方法的建立

为了建立一种快速诊断犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的多重PCR方法,参照GenBank中的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)基因序列,设计了3对引物分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(740 bp)、CPV(419 bp)和CPIV(559 bp)的多重PCR方法.结果表明特异性和敏感性良好,对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为1 ng/μL.临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对CDV、CPV、CPIV单个感染或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

上海市犬瘟热、犬细小病毒病感染状况调查

为及时了解上海市犬瘟热、犬细小病毒病的流行趋势,采用实时荧光PCR方法对106份宠物门诊的疑似样品、232份临床健康犬样品进行病原学检测。检测结果为:疑似样品检出中,犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)阳性率为50.0%,犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)阳性率为72.6%;临床健康犬的样品中,CDV的阳性率的4.74%,CPV的阳性率3.88%。检测结果反映了上海市犬瘟热、细小病毒在宠物群体中的感染情况,为这些宠物疫病的预防工作提供了科学数据。     

犬瘟热病毒和犬腺病毒2型双重PCR方法的建立及应用

根据犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬腺病毒2型(Canineadenovirus type2,CAV-2)GeneBank登陆的基因序列各设计一对引物,经试验条件优化,建立了检测CAV-2的PCR方法和CDV的RT-PCR方法,CAV-2可扩增1108bp片段、CDV可扩增560bp的目的片段,特异性试验表明建立的方法只能特异扩增CAV-2和CDV,不能扩增犬细小病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬钩端螺旋体和犬黄胆出血群、狂犬病病毒。敏感性试验表明,所建立的双重PCR方法可以扩增4.63ng总核酸量。在上述试验基础上继续优化条件建立了能同时检测CAV-2和CDV两种病毒的双重PCR检测方法,并用该方法检测来自辽宁、吉林等15家动物医院134份鼻液和眼眵样品,与商品化试纸条检测结果相比,本方法更加敏感和方便。研究结果表明,本实验建立的方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热病毒和犬腺病毒2型的快速检测和鉴别诊断。     

犬瘟热病毒间接免疫酶组化检测方法的建立

为对犬瘟热病毒(CDV)进行组织定位检查,本实验利用犬瘟热抗CDV单克隆抗体(MAb),采用间接免疫酶组化法对6只人工感染的比格犬肠组织的病毒抗原进行定位检测。结果表明,利用犬瘟热抗CDV MAb建立的间接免疫酶组化方法具有较高的特异性和灵敏性,可原位检测病犬肠组织中CDV抗原的分布,其抗原的阳性表达主要在小肠绒毛和李氏隐窝的上皮细胞胞浆内,表明CDV主要侵害小肠的粘膜上皮组织。     

犬瘟热病毒检测方法研究进展

犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起犬的一种急性、高度接触性传染病.该病的流行严重危害犬及毛皮动物养殖业的健康发展,且对濒危物种保护造成严重威胁.因此,准确、快速检测CDV感染是有效防控疫病传播的关键技术手段.论文介绍了CDV基因组结构、犬瘟热流行病学特点和临床症状,综合论述了CDV检测方法的研究进展,包括病毒分...     

犬瘟热的诊断和防制研究进展

犬瘟热是由犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus，CDV）感染而引起的一种急性、高度接触性传染病。CDV不但可感染犬科动物（如犬、狐、狼等），还能感染鼬科、浣熊科和猫科（如狮、虎、豹）等多种动物。近年来其感染范围不断扩大，已延伸至西湍、日本猕猴和人，甚至还从患Pagets疾病的病人组织中检测出CDV核酸，这使得犬瘟热有可能成为继狂犬病之后犬传播给人的第二种疫病，引起了动物学界及医学界的普遍关注。本文主要探索犬瘟热的诊断及防制的研究进展。１犬瘟热的诊断１．１常规方法诊断犬瘟热的常规诊断主要依据流行病学资料和临床…     

Prevalence and risk factors of astrovirus infection in puppies from French breeding kennels

Aiming at determining the prevalence and the risk factors associated to astrovirus infection in puppy, fecal samples were collected in 316 puppies (age from 5 to 14 weeks of age) from 33 French breeding kennels. Data were registered for each puppy, including age, breed, gender, origin of the dog, and feces quality. The samples were tested by specific RT-PCR for the presence of canine astrovirus. Astroviruses were identified in 20.9% (66/316) of the puppies and in 42% (14/33) of the breeding kennels. Young puppies (i.e. <7 weeks of age) and puppies from large breeding kennels were more likely to be infected by the astrovirus. No association between the quality of feces and astrovirus infection could be determined in this survey.     

RT-PCR检测贵州犬瘟热病毒

根据犬瘟热病毒H基因核苷酸序列 ,设计合成一对引物对贵州临床诊断为犬瘟热 (CD)病死犬的心、肝、脾、肾、粪便进行RT PCR检测。结果表明 :从心、脾、肾病料上清液中可扩增出 760bp的特异性带 ,与预期扩增片段长度相同 ;粪便和肝脏上清液RT PCR结果为阴性 ,但粪便上清液接种Vero细胞后连续传代 3代 ,每代细胞培养液RT PCR结果均为阳性 ;在检测的 2 2条病死犬中 ,有 1 9条病死犬检测到犬瘟热病毒H基因的特异性核酸片段 ,阳性率为 86 4% (1 9/ 2 2 )。     

水貂犬瘟热病毒LD-1株的分离与鉴定

取山东某貂场疑似犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）感染的水貂肝脏等组织病料,通过RT-PCR检测呈CDV阳性,且无水貂细小病毒存在,将病料接种原代CEF细胞、传代系Vero细胞和DF1细胞3种细胞进行病毒分离,通过优化细胞培养条件,最终在Vero细胞上传代培养成功,出现露珠状典型细胞病变（CPE）。分离毒应用RT-PCR、PCR产物测序、抗体中和试验（SN）、间接免疫荧光试验（IFA）及病毒包涵体检查等多种方法进行了CDV的鉴定,结果显示CDV阳性,表明分离到的病毒为水貂CDV,并将其命名为CDV LD-1株。     

成都地区宠物犬感染犬瘟热病毒和犬呼吸道冠状病毒的分子流行病学调查

为了解成都地区宠物犬犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）和犬呼吸道冠状病毒（canine respiratory coronavirus,CRCoV）的感染情况,本试验应用RT-PCR对采自成都地区8家动物医院共计420份出现呼吸道症状的宠物犬鼻腔棉拭子样本进行分子检测。结果发现,从420份样本中,检出213份CDV阳性,检出率为50.71%;检出247份CRCoV阳性,检出率为58.81%;CDV和CRCoV混合感染的检出率为41.19%。表明成都地区宠物犬感染CDV和CRCoV较为严重,且二者混合感染率较高。宠物犬CDV和CRCoV的检出率与年龄、性别、品种、季节和免疫状况等因素的关系存在不同程度的差异。其中,1~3月龄幼犬检出率最高,分别为74.40%和79.20%;纯种犬的检出率较其他犬种高,分别为59.37%和62.22%;春季CDV的检出率较高,为56.19%,而冬季CRCoV的检出率较高,为67.59%;未免疫犬的检出率较高,分别为64.42%和63.46%。该研究丰富了成都地区宠物犬CDV和CRCoV的流行病学资料,为该地区宠物犬CDV和CRCoV的诊断及防控提供了基本数据。     

Comparison of one-step RT-PCR and a nested PCR for the detection of canine distemper virus in clinical samples

OBJECTIVE: To develop a rapid and sensitive method for the detection of canine distemper virus (CDV) by nested PCR using clinical specimens. DESIGN: A nested PCR was developed, compared to a one-step RT-PCR and validated. PROCEDURE: Two sets of specific primers for a one-step RT-PCR and a nested PCR, targeting a 640 bp fragment and a 297 bp fragment, respectively, were selected from the highly conserved region of the nucleocapsid protein (NP) gene of CDV. The nested PCR and the one-step RT-PCR were used to amplify a part of the CDV NP gene of a CDV vaccinal strain and samples of urine, blood, nasal discharge and saliva from 29 dogs suspected of suffering CD. RESULTS: Both the one-step RT-PCR and the nested PCR reacted with the CDV vaccinal strain, but not with canine parvovirus. The expected 640 bp fragment of the NP gene was detected in 11/22 (50.0%) blood, 10/20 (50.0%) urine, 5/25 (20.0%) saliva and 6/27 (22.2%) nasal swab samples by one-step RT-PCR, whereas the nested PCR amplified an expected 297 bp fragment of the NP gene in 18/22 (81.8%) blood, 15/20 (75.0%) urine, 14/25 (56%) saliva and 19/27 (70.3%) nasal swab samples. CONCLUSION: The nested PCR detected CDV in blood, urine, nasal swab and saliva more frequently than did the one-step RT-PCR. Therefore, this assay should be a useful aid to antemortem diagnosis of CDV infections in dogs.     

貉源犬瘟热病毒血凝素基因的克隆及序列分析

为了对1例貉源犬瘟热(CD)进行病毒检测并分析其血凝素H基因变异情况,本研究从1只疑似犬瘟热病死的貉采病料进行研磨,利用RT-PCR方法扩增犬瘟热病毒H基因,对扩增出的H基因片段进行克隆测序,并对得到的H基因序列进行分析。结果表明,该貉感染犬瘟热病毒,得到的H基因核苷酸和氨基酸序列与CDV野毒株同源性较高,分别为89.1%~98.0%和85.4%~97.5%。遗传进化分析表明其属于Asia-1型野毒株,N连接糖基化位点分析结果表明,该毒株在542aa处比参考野毒株多了1个潜在的N糖基化位点,在525aa-550aa间多出了1个抗原表位。     

鉴别犬瘟热病毒疫苗株和野毒株RT—PCR—RFLP方法的建立及应用

根据Onderstepoort株H基因序列,设计1对引物建立RT-PCR-RFLP检测方法,对不同宿主来源的疑似犬瘟热临床样品进行检测,并对检出的犬瘟热病毒野毒山东株PCR产物进行克隆和序列分析,验证RT—PCR—RFLP检测方法。结果RT—PCR扩增片段为1921bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被NdeI酶切为1282、345和294bp3个片段,弱毒疫苗株则不能被切开;病毒RNA的最小检出量为2．15ng。临床检测共检出19份样品为犬瘟热阳性,其中15份为野毒株感染,其H基因编码区全长为1824bp,均在1279和1543处有NdeI酶切位点,推导氨基酸与野毒株的同源性在92．9％～96．9％,与疫苗株的同源性在89．0％～90．8％,进化树分析显示这些毒株在基因型上属于Asia-1型,为野毒株谱系。该方法的建立为临床上犬瘟热病毒的鉴别检测和诊断提供了依据。