同时检测犬瘟热病毒和犬细小病毒双重PCR方法的建立

为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的CDV N蛋白序列和CPV NS基因保守序列,设计合成2对特异性引物。通过优化反应条件,对CDV阳性病毒株反转录后的cDNA模板和CPV的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到2条与试验设计相符的669 bp(CDV)和392 bp(CPV)特异性条带,建立了同时检测CDV和CPV的双重PCR方法。实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测这2种病毒,而对犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病毒检测均为阴性;CDV和CPV的最低检出限分别为101.8TCID50和101.4TCID50。采用该方法对在黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为30%;CPV阳性率为23.33%,表明建立的PCR方法可以用于临床诊断。     

犬瘟热病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。     

犬瘟热病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。     

犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒三重PCR检测方法的建立

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)和犬冠状病毒(CCV)的基因序列保守片段分别设计特异性引物,建立了可以同时检测CDV(684 bp)、CPV(213 bp)和CCV(417 bp)的三重PCR方法。特异性结果表明,所建立的体系只能扩增CDV、CPV、CCV,而不能扩增犬腺病毒Ⅱ型(CAV-Ⅱ)和犬副流感病毒(CPIV);敏感性试验表明,该方法对CDV、CPV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10-2、6.0×10-2和6.7×10-2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。采用建立的三重PCR方法对北京、山东地区收集的临床粪便样品进行检测结果表明,使用三重PCR体系的扩增结果与单项PCR扩增结果一致,符合率为100%。以上结果表明该方法快速、敏感、特异性强,对上述3种病毒能够进行快速鉴定诊断,为临床诊断提供了快速简便的方法。     

CDV、CPV、CAV-2及CPIV多重PCR的建立及应用

为建立一种快速检测犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅱ型(CAV-2)和犬副流感病毒(CPIV)的多重PCR方法,参照Gen Bank中的相关病毒基因序列,分别设计了4对引物,用于特异性扩增CDV H基因、CPV VP2基因、CAV-2 E3基因和CPIV NP基因上的目的片段。通过优化反应条件,建立了同时扩增CDV(410 bp)、CPV(253 bp)、CVA-2(655 bp)和CPIV(868 bp)的多重PCR方法。利用建立的多重PCR方法,对CDV、CPV、CAV-2、CPIV、CDV+CPV+CAV-2+CPIV和犬冠状病毒(CCV)的DNA或c DNA模板进行扩增,发现该方法的特异性良好。利用建立的多重PCR方法与单一PCR方法进行敏感性比较,发现两者敏感性相差10倍,证明多重PCR方法敏感性良好。利用该方法对从北京市采集的30份犬病料样品进行检测,发现CDV阳性率为63.33%(19/30)、CPV阳性率为33.33%(10/30)、CAV-2阳性率为6.66%(2/30)、CPIV阳性率为0(0/30)。检测结果证明建立的多重PCR方法可用于临床诊断。     

同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、Ⅰ型和Ⅱ型犬腺病毒多重PCR方法的建立

为建立检测多种犬病的多重PCR方法,本研究根据GenBank登录犬瘟热病毒(CDV)的N基因序列、犬细小病毒(CPV)的NS基因序列和犬腺病毒(CAV)的E3基因序列,设计合成3对特异性引物.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV (507 bp)、CPV (287 bp)、CAV-Ⅰ (590 bp)和CAV-Ⅱ(1 027 bp)的多重PCR方法.实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测以上4种病毒,而狂犬病病毒检测为阴性;CDV、CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的最低检出限分别为101.9 TCID50、101.7 TCID50、101.7 TCID50和102.2 TCID50.利用该方法对由黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为23.33％(7/30)、CPV阳性率为20％(6/30)、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的阳性率均为3.33％(1/30),证明建立的PCR方法可以用于临床诊断.     

CDV、CPV和CPIV多重PCR检测方法的建立

为了建立一种快速诊断犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的多重PCR方法,参照GenBank中的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)基因序列,设计了3对引物分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(740 bp)、CPV(419 bp)和CPIV(559 bp)的多重PCR方法.结果表明特异性和敏感性良好,对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为1 ng/μL.临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对CDV、CPV、CPIV单个感染或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

5种常见犬腹泻病毒基因芯片检测方法的建立

为建立一种简便、快速、高效的可同时区分犬腺病毒1型（canine adenovirus type 1,CAV-1）、犬腺病毒2型（canine adenovirus type 2,CAV-2）、犬冠状病毒（canine coronavirus,CCV）、犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）、犬细小病毒（canine parvovirus,CPV） 5种常见犬腹泻病毒的基因芯片诊断方法,本研究以CAV-1、CAV-2、CCV、CDV、CPV 5种犬腹泻病毒为靶病毒,根据NCBI上收录的病毒基因序列在其保守区域内设计引物,在此基础上根据变异区域设计针对每种病毒的探针2~3条,优化检测体系的各反应条件,确定该检测方法的特异性与敏感性,建立可同时区分5种病毒的基因芯片检测方法。结果显示,建立的基因芯片检测方法可同时检测以上述5种犬腹泻病毒,其中PCR的退火温度为55℃、延伸时间为1 min 15 s;探针与PCR产物的杂交温度40℃、杂交时间2.5 h时,该方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒标准品的检测限分别为0.2 fg/μL、2 fg/μL、2 fg/μL、20 pg/μL和0.02 fg/μL,具有较高的灵敏性;同时对犬副流感病毒进行特异性试验,发现无阳性信号出现,具有较强的特异性;对14份临床腹泻样品检测结果显示,基因芯片方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒的阳性检出率分别为28.57%、50.00%、64.28%、14.28%和85.71%,并且基因芯片检测方法的敏感性较PCR要高10~100倍。以上结果表明,本研究建立的基因芯片检测方法具有特异、敏感等特点,对临床中犬类混合感染病毒检测具有一定的诊断意义。     

5种常见犬腹泻病毒基因芯片检测方法的建立

为建立一种简便、快速、高效的可同时区分犬腺病毒1型(canine adenovirus type 1,CAV-1)、犬腺病毒2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)、犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)、犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)、犬细小病毒(canine parvovirus,CPV) 5种常见犬腹泻病毒的基因芯片诊断方法,本研究以CAV-1、CAV-2、CCV、CDV、CPV 5种犬腹泻病毒为靶病毒,根据NCBI上收录的病毒基因序列在其保守区域内设计引物,在此基础上根据变异区域设计针对每种病毒的探针2～3条,优化检测体系的各反应条件,确定该检测方法的特异性与敏感性,建立可同时区分5种病毒的基因芯片检测方法。结果显示,建立的基因芯片检测方法可同时检测以上述5种犬腹泻病毒,其中PCR的退火温度为55℃、延伸时间为1 min 15 s;探针与PCR产物的杂交温度40℃、杂交时间2.5 h时,该方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒标准品的检测限分别为0.2 fg/μL、2 fg/μL、2 fg/μL、20 pg/μL和0.02 fg/μL,具有较高的灵敏性;同时对犬副流感病毒进行特异性试验,发现无阳性信号出现,具有较强的特异性;对14份临床腹泻样品检测结果显示,基因芯片方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒的阳性检出率分别为28.57%、50.00%、64.28%、14.28%和85.71%,并且基因芯片检测方法的敏感性较PCR要高10～100倍。以上结果表明,本研究建立的基因芯片检测方法具有特异、敏感等特点,对临床中犬类混合感染病毒检测具有一定的诊断意义。     

表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒的构建与鉴定

将犬瘟热病毒 ( canine distemper virus,CDV ) H基因表达盒克隆入转移质粒 p VAXΔE3,构建含 CDV H基因表达盒的转移质粒 p VAXΔ E3L PH,用 Nru 和 Sal 分别酶切转移质粒 p VAXΔ E3L PH和犬 2型腺病毒全基因组质粒p Poly2 - CAV- 2 ,将 CDV H基因表达盒定向克隆入 p Poly2 - CAV- 2质粒中 ,构建 E3区部分缺失的包含 CDV H基因表达盒的犬 2型腺病毒重组质粒 p CAV- 2 / CDVL PH。 Asc 和 Cla 对 p CAV- 2 / CDVL PH进行双酶切 ,释放 CAV- 2 /CDVL PH重组基因组 ,利用脂质体将 CAV- 2 / CDVL PH重组基因组与去除 Sal 和 Nru 片段的 CAV- 2基因组两端片段共转染 DK细胞 ,盲传和重复转染 3次 ,4 d后出现典型 CAV- 2病变 ,获得重组病毒 CAV- 2 / CDVL PH。用 CDV H基因特异性引物经 RT- PCR扩增重组病毒 DK细胞培养物 ,能够扩增出相应的核酸片段 ,表明 CAV- 2 / CDVL PH在DK细胞繁殖的过程中能够转录 CDVL P H的 m RNA,重组病毒免疫犬 ,可以诱导犬产生特异的抗 CAV- 2 HI抗体和抗 CDV中和抗体     

犬瘟热—犬冠状病毒双重PCR诊断方法的建立及初步应用

Two pairs of PCR primers were designed according to sequence of canine distemper virus （CDV） and canine coronavirus （CCV） from GenBank, respectively, which could amplify 550 bp fragment for CDV and 225 bp fragment for CCV. The products of PCR were cloned to pMD18-T for sequencing, which proved to be specific. Positive plasma were developed for standard DNA, and the sensitivity result of duplex PCR showed that the method could amplify 0.1 ng/μL nucleic acid for both of viruses. The result of rudimentary application showed that the method was specific, sensitive, efficient, and was a new detecting method for the mixed infection of CDV and CCV.     

犬细小病毒和犬冠状病毒双重PCR方法的建立及应用

根据GenBank中犬细小病毒(CPV)和犬冠状病毒(CCV)基因序列各设计了一对引物,经试验条件的优化,建立了检测CPV的PCR方法和CCV的RT-PCR方法,扩增目的片段大小分别为337 bp和852 bp.在此基础上建立了检测CPV和CCV双重PCR方法.该双重PCR方法能特异的扩增CPV和CCV,且分别扩增出1...     

用半套式PCR检测犬瘟热病毒的研究

根据ＧｅｎＢａｎＫ中Ｂａｒｒｅｔｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的附着或血凝蛋白基因序列,设计合成了能扩增７６０ｂｐ基因片段的半套式引物。用异硫氰酸胍－－酚－－仿一步抽取法提取细胞总ＲＡＮ进行反转录,再以此产物进行半套式ＰＣＲ扩增,并筛选出最佳ＰＣＲ扩增。结果经半套式ＰＣＲ扩增能得到与设计片段大小相同的产物,并且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒的核酸。敏感性试验     

Detection and Differentiation of CAV-1 and CAV-2 by Polymerase Chain Reaction

Canine adenovirus type 1 (CAV-1) and type 2 (CAV-2) can be categorized in the laboratory by haemagglutination and neutralization tests, but they are difficult to differentiate from each other in specimens, especially when infection occurs in the digestive tract. The object of this study was to develop a simple method of detecting and differentiating them. One pair of common primers was designed and synthesized according to the sequences of the E3 and flanking regions and a polymerase chain reaction (PCR) assay was established using these two primers to amplify the virus-specific DNA fragment from clinical specimens as well as from cell cultures. After electrophoresis, under the same amplification conditions, 508 bp and 1030 bp PCR products were observed for CAV-1 and CAV-2, respectively. These were further shown to be adenovirus specific by dot hybridization and sequencing. As only one pair of primers was involved in the PCR procedure, it was faster and easier to perform than any of the other assays used for detecting canine adenovirus, making it applicable in the rapid confirmation of diagnosis and differentiation of the two types of canine adenoviruses.     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒融合蛋白F基因序列,设计合成了1对寡聚核苷酸引物,扩增大小为337bp的目的片段,建立犬瘟热病毒F基因的RT-PCR检测方法。结果表明,该方法具有很强的特异性和很高的敏感性,可作为犬瘟热临床快速诊断的一种方法。     

Comparison of one-step RT-PCR and a nested PCR for the detection of canine distemper virus in clinical samples

OBJECTIVE: To develop a rapid and sensitive method for the detection of canine distemper virus (CDV) by nested PCR using clinical specimens. DESIGN: A nested PCR was developed, compared to a one-step RT-PCR and validated. PROCEDURE: Two sets of specific primers for a one-step RT-PCR and a nested PCR, targeting a 640 bp fragment and a 297 bp fragment, respectively, were selected from the highly conserved region of the nucleocapsid protein (NP) gene of CDV. The nested PCR and the one-step RT-PCR were used to amplify a part of the CDV NP gene of a CDV vaccinal strain and samples of urine, blood, nasal discharge and saliva from 29 dogs suspected of suffering CD. RESULTS: Both the one-step RT-PCR and the nested PCR reacted with the CDV vaccinal strain, but not with canine parvovirus. The expected 640 bp fragment of the NP gene was detected in 11/22 (50.0%) blood, 10/20 (50.0%) urine, 5/25 (20.0%) saliva and 6/27 (22.2%) nasal swab samples by one-step RT-PCR, whereas the nested PCR amplified an expected 297 bp fragment of the NP gene in 18/22 (81.8%) blood, 15/20 (75.0%) urine, 14/25 (56%) saliva and 19/27 (70.3%) nasal swab samples. CONCLUSION: The nested PCR detected CDV in blood, urine, nasal swab and saliva more frequently than did the one-step RT-PCR. Therefore, this assay should be a useful aid to antemortem diagnosis of CDV infections in dogs.     

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）基因组全序列，选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4，并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3，用引物P1／P4进行RT—PCR，然后用引物P2／P3／P4进行复合套式PCR，建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应（RT—nPCR）的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段，从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段，与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT—nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明，有15份类似CDV强毒，5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT—nPCR可以有效检测CDV感染，能够将强、弱毒株区分开，可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。     

鉴别犬瘟热病毒疫苗株和野毒株RT—PCR—RFLP方法的建立及应用

根据Onderstepoort株H基因序列,设计1对引物建立RT-PCR-RFLP检测方法,对不同宿主来源的疑似犬瘟热临床样品进行检测,并对检出的犬瘟热病毒野毒山东株PCR产物进行克隆和序列分析,验证RT—PCR—RFLP检测方法。结果RT—PCR扩增片段为1921bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被NdeI酶切为1282、345和294bp3个片段,弱毒疫苗株则不能被切开;病毒RNA的最小检出量为2．15ng。临床检测共检出19份样品为犬瘟热阳性,其中15份为野毒株感染,其H基因编码区全长为1824bp,均在1279和1543处有NdeI酶切位点,推导氨基酸与野毒株的同源性在92．9％～96．9％,与疫苗株的同源性在89．0％～90．8％,进化树分析显示这些毒株在基因型上属于Asia-1型,为野毒株谱系。该方法的建立为临床上犬瘟热病毒的鉴别检测和诊断提供了依据。