牛冠状病毒和轮状病毒的双重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速诊断牛病毒性腹泻疾病的方法,利用本研究室分离鉴定的牛冠状病毒(BCV)和牛轮状病毒(BRV)毒株,根据GenBank中登录的BCV、BRV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增BCV、BRV的引物,经过条件优化,建立了检测BCV、BRV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为244 bp和382 bp.该方法检测BCV和BRV的敏感度分别为1个和100个TCID50/100μL.应用这一方法能从病料中检测出这2种病毒.结果表明该双重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于这2种病毒性疾病的快速诊断.     

新城疫特异性转移因子的免疫作用研究

将新城疫特异性转移因子(Newcastle disease-specific transfer factor,ND-STF)1 mL单独或与La Sota弱毒疫苗一起,分别口服和注射试验鸡,然后用MTT法检测各组鸡外周血淋巴细胞转化率;用La Sota疫苗免疫鸡,同时口服或注射0.1、0.5、1 mL 3种不同剂量的ND-STF,然后检测血清中新城疫病毒HI抗体效价.在使用ND-STF后第5天,试验组鸡的淋巴细胞转化率达到高峰,刺激指数(stimulation index,SI)可达1.68～1.71,对照组的SI值为1.24～1.34,试验组与对照组差异显著(P<0.05),各试验组之间差异不显著(P>0.05);鸡的HI抗体效价(log2X)在免疫后第28天达到高峰,口服或注射ND-STF 3种不同剂量组HI抗体效价分别为10、9.25、10和6.3、9、8.3,使用ND-STF各组与未使用组相比较差异显著(P<0.05),且口服的效果更好.表明ND-STF能够增强鸡的细胞免疫和体液免疫能力.     

牛冠状病毒RT—PCR检测方法的建立

牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)是引起新生犊牛腹泻和成年牛冬痢、呼吸道疾病最主要的病原之一,临床上主要表现为新生犊牛腹泻拉血样粪便,成年牛冬季严重水样腹泻(有时伴有血和黏液)等特征.     

牛冠状病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立牛冠状病毒(BCV)检测方法,利用构建的pET30a-N重组质粒高效表达了BCV重组N蛋白.western blot检测该重组蛋白具有很好的免疫活性.以纯化的蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为1.75 μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:200,酶标二抗最佳稀释倍数为1:8 000,建立了检测BCV抗体的间接ELISA方法.用该法对黑龙江一些地区采集到的256份牛血清样品进行检测,结果阳性率为65.23%,与病毒中和试验方法的检测结果符合率达95.31%.本研究建立的间接ELISA方法为BCV的检测和区域流行病学调查提供了一种快速简便的血清学诊断方法.     

貉源犬瘟热病毒的分离鉴定

采集大庆某貉养殖场病貉的病料,处理后接种于非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离。对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定,并用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测感染细胞中的病毒核酸。病料接种 Vero 细胞 72 h 后产生明显的细胞病变(CPE);病毒分离株可以被犬瘟热病毒阳性血清中和,中和效价为 1∶25;分离株对氯仿、乙醚敏感,对酸和热抵抗力弱,可以凝集鸡红细胞,其凝集作用可被犬瘟热病毒阳性血清所抑制; RT-PCR检测病毒细胞培养液,扩增出的片段长287 bp,与预期设计的长度相同,经测序发现与MS01株的同源性为99%。结果表明,分离的病毒株为犬瘟热病毒,命名为CDV-DQ株。     

牛腺病毒7型PCR检测方法的建立

根据GenBank中牛腺病毒7型(BAdV-7)的蛋白酶基因序列,设计一对特异性的引物,扩增该序列中775 bp的片段,建立了BAdV-7的PCR检测方法.以Fukuroi株BAdV-7 DNA为模板进行特异性和敏感性试验,结果显示,该方法检测BAdV-7 DNA最小检测量为1ng;与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼吸道舍胞体病毒(BRSV)和鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)无交叉反应.方法为BAdV-7感染的临床诊断和流行病学调查奠定了基础.