乳酸乳球菌乳脂亚种IMAU60064增殖培养基的优化

以分离自西藏那曲县罗玛镇传统发酵酸牦牛奶中的乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp．Cremoris）IMAU60064为试验菌株,研究其最佳的培养条件。对碳源、氮源、缓冲盐等培养基成分及培养条件进行优化,并采用响应面法对优选的碳源、氮源和缓冲盐类的组成含量进行优化,得到IMAU60064的增殖培养基为：葡萄糖23g／L、大豆蛋白胨11g／L、牛肉膏11g／L、胰蛋白胨5g／L、NaAC1．8g／L、K2HP041．2g／L、柠檬酸钠1．2g／L、MgSO4·7H200．4g／L、MnSO4·5H2O54mg／L、L-半胱氨酸盐酸盐0．5g/L、吐温80为1g／L。Lactococcus lactis subsp．cremorisIMAU60064在此增殖培养基中经30℃,14h培养活菌数可达到3．26×10^8cFu／mL,比在MRS中（6．54×10^7CFU／mL）提高近5倍。     

一种新的精子膜蛋白sp18基因的克隆及其在E.coli 中的表达

摘要：利用sp18 mAb筛选小鼠睾丸λgt11-cDNA表达文库,命名为sp18（GenBank登录号：AF129872）的阳性克隆由 1 468 bp组成,开放阅读框（open reading frame, ORF）长约429 bp,编码142个氨基酸。起始密码ATG位于第694 bp,终止密码位于第1 122 bp,polyA位于1 245~1 250 bp。核苷酸同源性分析表明,sp18 cDNA的10~651 bp与人视神经Hr44的532~ 1 173 bp、sp18 cDNA的10~816 bp、864~1 444 bp与牛视神经Hr44的1 408~2 208 bp、2 250~2 309 bp的cDNA序列有很高的同源性, 高达98%。推测sp18基因可能是生殖系统存在的一种新基因。sp18编码蛋白的理论分子量约为15.7 kD,有8个N-糖基化位点和12个O-糖基化位点,亲水性分析表明sp18多肽是一种精子跨膜蛋白,跨膜区位于第17~33氨基酸处。将sp18 cDNA亚克隆到原核表达载体pET-30a(+),在E. coli BL21（DE3）中得到诱导表达,其表观分子量约为16.5 kD,表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot分析表明sp18 mAb能识别重组的sp18膜蛋白,表明重组蛋白具有免疫原性,为进一步研究sp18基因的功能打下了基础。     

利用精子介导法建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型

为探讨超急排斥反应(Hyperacute rejection,HAR)及延迟性异种排斥反应(Delayed xenograft rejection,DXR)的分子调控机制,采用优化的精子介导法(Sperm-mediated gene transfer,SMGT)对建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型进行了研究。结果表明,应用树枝状聚合物(Dendrimers)优化SMGT后,2细胞胚GFP+RFP的阳性率达到4.51%,同对照组相比差异极显著(P0.01)。选取标记基因GFP+RFP双阳性的胚胎进行移植后获得36只仔鼠,PCR及Southern Blot检测结果表明,17只小鼠PCR结果呈hHT+hDAF双阳性,其中5只小鼠Southern Blot结果呈hHT+hDAF双阳性。上述结果表明,成功建立了Hht/hDAF双基因转移小鼠模型。     

牛β-酪蛋白座位无启动子基因打靶载体的构建

将带有新霉素基因(neo)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的质粒pEGFP-C1进行了改造,去掉neo基因的启动子(Psv40),在无启动子的neo和完整的GFP基因两侧分别加入一个LoxP位点。然后将带有LoxP位点、筛选标记基因和报告基因的结构装入左右分别为牛β-casein基因1590bp和5833bp的同源臂结构中,构建成无启动子基因打靶载体pT-1590-LoxP-GFP-LoxP-5833。     

利用转基因小鼠表达法氏囊病毒A片段的研究

摘要： 将法氏囊病毒(IBDV)A片段定向连于乳腺特异性表达载体p7GMB53, 用于转基因实验, 用PCR和Southern杂交对阳性小鼠及其后代进行检测。 共注射了879枚小鼠受精卵, 移植受体26只, 产仔39只。 经PCR检测阳性6只（其中2只死胎）,Southern杂交检测确定了2只阳性小鼠(1公1母)。外源基因整合的拷贝数分别为3拷贝（公）和9拷贝（母）。将两只阳性小鼠进行了传代,实验表明二者分别为种系纯合体及种系嵌合体。 ELISA 及Western blot检测认为阳性母鼠表达了IBDV 衣壳蛋白。初步验证了先前构建的含基质附着区序列（MARs）的乳腺表达载体能克服转基因的位置效应,实现转入目的基因的表达,提高乳腺反应器的制备效率。     

鸡γ-干扰素cDNA的克隆和在大肠杆菌中的温度诱导型表达

克隆了鸡(Gallus gallus)的γ-干扰素cDNA，并用大肠杆菌(Escherichia coli)进行了温度诱导型表达。用PCR方法扩增了鸡γ-干扰素基因组基因，将其克隆到载体pGEM-T上。对重组载体的插入片段进行酶切分析和部分序列测定：证明了基因的正确性；克隆的鸡γ-干扰素基因的编码序列中存在一个点突变(G→A)，这一突变导致一个三联体密码子GAA变为AAA，编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys)。用鸡γ-干扰素基因组基因构建了真核表达载体pCI-ChIFN。将这一真核表达载体转染兔成纤维细胞的细胞系中进行表达实验：提取转染后细胞裂解物中的RNA，再以此为模板进行RT—PCR，获得了完整的鸡γ-干扰素cDNA基因，同时证明鸡γ-干扰素基因组基因能在兔成纤维细胞系中表达。用鸡γ-干扰素cDNA构建了温度诱导型原核表达载体pBVcDNA，并将其转导到大肠杆菌DH5α中，经细菌发酵和温度诱导，表达了一个18kD的特异蛋白，其表达量占细菌总蛋白的8．75％。     

用PCR法从cDNA文库中快速克隆基因

以λgtll为载体,构建家兔睾丸文库.平板扩增6×105pfus,提取λDNA作为PCR模板.根据GenBank已发表spl0cDNA的同源序列,选择高度保守区域设计5'端引物(SP5'),另加与构建文库载体λgtll序列互补的正向(FP)或反向引物(RP)共同配对组成PCR循环引物.利用SP5'+Rp或SP5'+FP引物对扩增出sp10cDNA的3'端.根据3'端的测序结果,设计sp10的3'端引物(SP3'),利用SP3'+RP或SP3'+FP引物对扩增出sp10cDNA的5'端.应用该方法成功地克隆了家兔精子膜蛋白sp10cDNA(rsp10),说明该方法是一种快捷可行的cDNA克隆方法.     

提高PCR产物T-A克隆效率的研究

摘要：比较了3种T-A克隆法对于4个不同长度PCR产物的克隆效率。结果表明,对于较短的PCR产物（500 bp左右）,采用常规的T-A克隆法即可得到较高的克隆效率;对于中等长度的PCR产物(3 000 bp左右),用温度循环T-A克隆法可获得较高的克隆效率;对于较长的PCR产物（6 000 bp左右）,用二次重组T-A克隆法可以提高克隆效率。     

转基因羊研究进展

转基因动物已成为当今生命科学发展的热点，其中转基因羊的研究又是转基因动物中较为活跃的领域。自1985年用显微注射法获得了第1只转基因羊以来，随后有关转基因羊获得成功及取得突破的相关报道逐渐增多；同时转基因羊的研制目的也从当初的转基因育种逐渐倾向于乳腺生物反应器，并亦取得显著成效。本文就此作一简要综述。