一种新的精子膜蛋白sp18基因的克隆及其在E.coli 中的表达

摘要：利用sp18 mAb筛选小鼠睾丸λgt11-cDNA表达文库,命名为sp18（GenBank登录号：AF129872）的阳性克隆由 1 468 bp组成,开放阅读框（open reading frame, ORF）长约429 bp,编码142个氨基酸。起始密码ATG位于第694 bp,终止密码位于第1 122 bp,polyA位于1 245~1 250 bp。核苷酸同源性分析表明,sp18 cDNA的10~651 bp与人视神经Hr44的532~ 1 173 bp、sp18 cDNA的10~816 bp、864~1 444 bp与牛视神经Hr44的1 408~2 208 bp、2 250~2 309 bp的cDNA序列有很高的同源性, 高达98%。推测sp18基因可能是生殖系统存在的一种新基因。sp18编码蛋白的理论分子量约为15.7 kD,有8个N-糖基化位点和12个O-糖基化位点,亲水性分析表明sp18多肽是一种精子跨膜蛋白,跨膜区位于第17~33氨基酸处。将sp18 cDNA亚克隆到原核表达载体pET-30a(+),在E. coli BL21（DE3）中得到诱导表达,其表观分子量约为16.5 kD,表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot分析表明sp18 mAb能识别重组的sp18膜蛋白,表明重组蛋白具有免疫原性,为进一步研究sp18基因的功能打下了基础。     

牛β-酪蛋白座位无启动子基因打靶载体的构建

将带有新霉素基因(neo)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的质粒pEGFP-C1进行了改造,去掉neo基因的启动子(Psv40),在无启动子的neo和完整的GFP基因两侧分别加入一个LoxP位点。然后将带有LoxP位点、筛选标记基因和报告基因的结构装入左右分别为牛β-casein基因1590bp和5833bp的同源臂结构中,构建成无启动子基因打靶载体pT-1590-LoxP-GFP-LoxP-5833。     

利用转基因小鼠表达法氏囊病毒A片段的研究

摘要： 将法氏囊病毒(IBDV)A片段定向连于乳腺特异性表达载体p7GMB53, 用于转基因实验, 用PCR和Southern杂交对阳性小鼠及其后代进行检测。 共注射了879枚小鼠受精卵, 移植受体26只, 产仔39只。 经PCR检测阳性6只（其中2只死胎）,Southern杂交检测确定了2只阳性小鼠(1公1母)。外源基因整合的拷贝数分别为3拷贝（公）和9拷贝（母）。将两只阳性小鼠进行了传代,实验表明二者分别为种系纯合体及种系嵌合体。 ELISA 及Western blot检测认为阳性母鼠表达了IBDV 衣壳蛋白。初步验证了先前构建的含基质附着区序列（MARs）的乳腺表达载体能克服转基因的位置效应,实现转入目的基因的表达,提高乳腺反应器的制备效率。     

提高PCR产物T-A克隆效率的研究

摘要：比较了3种T-A克隆法对于4个不同长度PCR产物的克隆效率。结果表明,对于较短的PCR产物（500 bp左右）,采用常规的T-A克隆法即可得到较高的克隆效率;对于中等长度的PCR产物(3 000 bp左右),用温度循环T-A克隆法可获得较高的克隆效率;对于较长的PCR产物（6 000 bp左右）,用二次重组T-A克隆法可以提高克隆效率。     

绵羊体内外受精胚胎玻璃化冷冻保存

用 EFS4 0溶液对绵羊体内外受精的早期囊胚进行了玻璃化冷冻保存的研究。经卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养获得的早期囊胚 ,分别作如下处理 :( A) 1 0 %EG中预处理 5min后 ,在 EFS4 0平衡 3 0 s(两步法 ) ;( B) EFS4 0中平衡 1 min(一步法 ) ;( C) EFS4 0中平衡 2 min(一步法 )。然后投入液氮中冷冻保存 ,解冻胚胎的继续发育率分别为 80 %、78%和 50 %,A、B2组的结果与对照组 ( 88%)无显著性差异 ( P >0 .0 5)。经超数排卵获得的体内受精早期囊胚用两步法冷冻保存 ,解冻后胚胎发育继续率为 89%,与对照组( 93 %)也无显著性差异 ( P >0 .0 5)     

生物频谱对牛胚胎体外生产效率的影响

利用可调式周林生物频谱发生器对牛卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养过程实施辐射,以提高牛胚胎体外生产效率。频谱发生器与培养材料的距离为５ｃｍ,辐射强度根据辐射温度加以调节。结果表明,辐射温度控制在３９℃时,入孵卵母细胞的卵裂率（６３％）与对照组６１（％）无显著差异（Ｐ〉０．０５）,而囊胚发育率（３９％）显著高于对照组（１９％）（Ｐ〈０．０５）;当辐射温度达到４０℃时,试验组的卵裂率仅为１４％,囊     

动物体细胞克隆技术及其应用前景

介绍了体细胞克隆技术及这一高新技术在生产转基因动物和动物遗传资源保存上的应用.     

人肥胖基因(Obese)转基因小鼠动物模型的建立

用三个含有兔乳清酸性蛋白基因(rWAP)启动子,人ob基因(cDNA)及rWAP基因终止子的质粒经亚克隆构建了融合表达载体.用NotI消化表达载体,回收包含上述三个表达元件且插入方向正确的片段(约7.5 kb)并进行显微注射.注射用的DNA浓度为2 g/mL,每mL注射液中DNA的拷贝数约为2.4??011 ,每一枚原核期小鼠胚胎注射1～2 pL.采用标准的显微注射方法,获得48只后代小鼠.四周龄时剪尾并提取尾组织DNA,以人ob基因cDNA为探针,用EcoRI消化总组织DNA,经Southern杂交确证其中两只母鼠为转人ob基因小鼠.在出生的后代小鼠中,转基因阳性率约为4 %(2/48).     

抗精子sp18单克隆抗体对小鼠体外受精胚胎发育的抑制作用

哺乳类受精时，精子的多种膜蛋白、顶体蛋白和胞质蛋白参与了受精过程，因此，研究人员的目光都集中在这些功能蛋白在睾丸中的生成、附睾中的水解和扩散、顶体反应中的作用和扩散以及它们在受精过程中的主要功能等。然而，对于精子蛋白在受精后的命运这个基本问题的研究，几乎是个空白领域。可以肯定的是，精子的顶体区膜蛋白和顶体蛋白在受精过程中被释放；胞质蛋白和顶体内膜蛋白通过胞吞作用进入卵子内部，其中，胞质中的钙振荡蛋白可以激活卵子，是新生命的发动者；顶体后区和尾部膜蛋白伴随着受精过程掺入卵子质膜，演化成受精卵的质膜蛋白，对于这类蛋白的最终结局和潜在的功能，我们的认识还很有限，英国生物学家发现，大鼠精子尾部的2D6膜蛋白（23 kD）掺入受精卵质膜后，随着胚胎发育过程而逐渐弱化，至2-细胞期时，胚胎表面的2D6完全消失，因此无法研究该抗原在胚胎发育中是否具有生理功能，这方面的研究工作处于停滞状态。     

应用重组肌肉抑制素C-端重组蛋白提高仔鼠出生质量的研究

为探讨利用重组肌肉抑制素促进肌肉生长的可能性,本研究原核表达并纯化了肌肉抑制素C-端重组蛋白.将雌性小鼠同雄性小鼠合笼,妊娠后分笼饲养.应用重组蛋白免疫雌性昆明白小鼠.利用间接ELISA法检测抗血清效价.每周测母鼠及仔鼠体质量1次.结果表明:(1)免疫后对照组和试验组母鼠体质最差异不显著(P>0.05).在妊娠后期(免疫后第11周),两组间体质量出现差异(P<0.05),试验组为(56.23±3.37)g,而对照组为(64.11±3.18)g.试验组体质量在第12周达到(79.16±3.72)g.而对照组为(75.23±3.44)g,差异极显著(P<0.01).分娩后,这种差异消失(P>0.05).(2)仔鼠出生体质量在2处理组间差异极显著(P<0.01),试验组仔鼠出生体质量比对照组增加25.8%左右;但在生长阶段仔鼠体质量差异有逐渐缩小的趋势.结论:应用肌肉抑制素C-端重组蛋白免疫母鼠可以显著提高仔鼠出生体质量.