猪繁殖和呼吸综合症山东分离株ORF7基因的克隆、测序及鉴定

山东某些养殖场发生以母猪流产或产死胎、木乃伊等为特症的流行性繁殖障碍病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)所致.自行设计了一对针对PRRSV的N基因的特异性引物P1和P2,通过RT-PCR技术对分别从潍坊和济南收集到的可疑病料进行检测,结果为阳性,并得到1条366bp的DNA片段.纯化此扩增产物,然后与PMD-18T载体连接,转化大肠杆菌DH5α.结果得到了1个ORF7基因与PMD-18T载体的重组质粒PMD-18T-ORF7.通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR证明此重组质粒即为ORF7基因与PMD-18T载体的重组质粒,从而为ORF7基因及其表达的核衣壳蛋白进一步研究奠定了基础.     

美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位基因表达及其产物的纯化

对原核中以包涵体形式高效表达的美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位区段进行了变性、复性与纯化研究。将美洲型PRRSV重组质粒pGEX-6P-1-N转化入E.coliBL21(DE3)细胞中,成功表达了重组蛋白GST-N,超声裂解复性后目的蛋白经GSTrap FF纯化试剂盒纯化后,纯度可达90%以上。将欧洲型PRRSV重组质粒PQE30-N转化入E.coliM15细胞中表达了重组蛋白His-N。超声裂解后目的蛋白经HisTrapHP蛋白纯化试剂盒纯化后,纯度可达95%以上。Western blot结果表明,两种蛋白分别被美洲型和欧洲型PRRSV阳性血清识别。纯化出的大量美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位区段,为PRRSV的鉴别诊断提供了抗原基础。     

板蓝根、黄芪对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外抑制作用

为了解中草药黄芪、板蓝根对病毒增殖的抑制作用,对黄芪、板蓝根及二者联合使用在Marc-145的单层细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的抑制作用进行了研究。结果表明,板蓝根能够显著抑制PRRSV体外增殖,对PRRSV的最小直接杀灭浓度为0.195 mg/mL,最小阻断浓度为0.097 mg/mL;黄芪对PRRSV增殖的抑制作用较弱。板蓝根、黄芪联合使用时对PRRSV的抑制作用显著增强,板蓝根对PRRSV的最小直接杀灭浓度降为0.097 mg/mL,最小阻断浓度降为0.049 mg/mL。     

重组GP5AB蛋白间接ELISA检测PRRSV抗体方法的研究

利用GST-GP5AB重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法。抗原最适包被浓度为2μg/mL,最佳封闭液为0.15%BSA,37℃封闭2 h后,再4℃封闭24 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60m in,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为90 m in,37℃显色10 m in,S/P≥0.284为阳性,S/P≤0.26为阴性,介于二者之间为可疑的判定标准。该抗原与猪其他4种临床症状类似的疾病的阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果,变异系数均小于7%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法初步检测了一些疫苗免疫仔猪血清样品,并与重组N蛋白和PRRSV抗原同时进行比较,结果显示3种抗原检测的结果基本一致。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建

从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。     

表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2基因的重组鸡痘病毒的构建及鉴定

分别将猪圆环病毒2型的ORF2基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因,插入到鸡痘病毒转移载体pUTA2-16-LacZ单一启动子和复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-ORF5-ORF2。将该重组质粒与鸡痘病毒282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞,进行同源重组。通过3次溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)加压筛选,经RT-PCR、IFA和Western blot鉴定,表明重组鸡痘病毒中的目的基因在鸡胚成纤维细胞中得到表达,获得一株携带有目的基因ORF2和ORF5的重组鸡痘病毒rFPV-ORF2-ORF5。     

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)诊断DNA微阵列的构建

为构建猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）诊断DNA微阵列，应用RT—PCR从猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）C14—2分离株和欧洲型弱毒疫苗株VP046扩增并克隆获得戋洲型重组质粒C14P9（基因号：AY775132）、PRRS—PS9（基因号：AY775134）、Ulb（基因号：AY775135）、Y11（基因号：AY775133）、Y12（基因号：AY775136）和欧洲型基因重组质粒E6和E8。PCR法制备的靶基因和探针纯化后，质量浓度分别为300～600mg／L和200-400mg／L。芯片杂交动力学研究表明，杂堑信号强度随靶基因和探针浓度的增加而增强，最佳靶基因质量浓度为200mg／L，探针适宜范围为3～3000μg／L，系统灵敏性为3μg／L。靶基因杂交特异性研究表明，除个别靶基因在某一温度下存在交叉反应和杂交信号弱外，大多数靶基因在40～56℃下杂交信号强。采用AY775133、AY775134、E6和E8靶基因构建PRRS诊断DNA微阵列在40℃下预杂交1h、48℃湿盒避光杂交6h后经洗涤和扫读分析，杂交信号强、斑点明显、特异性高，按SNR≥1．5为标准能够区分PRRSV蔓洲型和欧洲型。应用PRRS诊断DNA微阵列检测了AMERVAC-PRRS、PRRSV弱毒疫苗、C14—2株、SCU株和临床样本，能正确区分PRRSV基因型。研究结果表明构建的PRRS诊断DNA微阵列可用于PRRS临床诊断和基因分型。     

猪瘟病毒猪细小病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒猪伪狂犬病病毒多重PCR方法的建立以及初步应用

猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪伪狂犬病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。本研究通过设计4对针对这4种病毒的特异引物建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:其敏感性可达到CSFV 10 TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50 CSFV 10TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50。同时具有较好的特异性,对猪瘟病毒石门株、猪瘟病毒兔化弱毒株、PRV闽南A株、PPV弱毒疫苗株、PRRSV KY 35株及PRRSV B13株6个毒株均能扩增出相应的片段,而BVDV、BDV均未扩增出相应的片段。本方法的建立对于这4种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的构建

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR/PCR扩增,分别扩增出大小为308 bp和417 bp的部分基因片段。用T4连接酶将目的片段与pGEM-Teasy载体系统连接,并转化到大肠杆菌DH-5α株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV和PCV2的阳性重组质粒。将重组标准质粒10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR),建立了PRRSV、PCV2的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为分析PRRSV和PCV2共感染猪体内病毒的绝对含量提供了必要的技术平台。     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建及其免疫效果

构建了泛素（ubiquitin，Ub）基因与密码子优化的PRRSVGP5蛋白（optiGP5）基因融合表达质粒pIR—Ub—optiGP5。间接免疫荧光和Western—blot分析表明，重组质粒转染293T细胞后能够瞬时表达。将pIR—optiGP5和pIR—Ub—optiGP5两种质粒DNA肌肉注射免疫BALB／c小鼠后，分别检测小鼠血清中抗GP5抗体、T淋巴细胞的增殖能力以及CTL活性。结果显示，pIR—optiGP5质粒免疫组在二免后可以检测到荧光抗体，而pIR—Ub—optiGP5质粒免疫组一直未检测到抗GP5抗体，但该免疫组的T淋巴细胞增殖指数及针对GP5的特异性CTL反应数值明显高于pIR—optiGP5质粒免疫组。这表明泛素与GP5的融合表达可增强细胞免疫反应。