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101.
重组GP5AB蛋白间接ELISA检测PRRSV抗体方法的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
利用GST-GP5AB重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法。抗原最适包被浓度为2μg/mL,最佳封闭液为0.15%BSA,37℃封闭2 h后,再4℃封闭24 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60m in,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为90 m in,37℃显色10 m in,S/P≥0.284为阳性,S/P≤0.26为阴性,介于二者之间为可疑的判定标准。该抗原与猪其他4种临床症状类似的疾病的阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果,变异系数均小于7%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法初步检测了一些疫苗免疫仔猪血清样品,并与重组N蛋白和PRRSV抗原同时进行比较,结果显示3种抗原检测的结果基本一致。 相似文献
102.
构建了泛素(ubiquitin,Ub)基因与密码子优化的PRRSVGP5蛋白(optiGP5)基因融合表达质粒pIR—Ub—optiGP5。间接免疫荧光和Western—blot分析表明,重组质粒转染293T细胞后能够瞬时表达。将pIR—optiGP5和pIR—Ub—optiGP5两种质粒DNA肌肉注射免疫BALB/c小鼠后,分别检测小鼠血清中抗GP5抗体、T淋巴细胞的增殖能力以及CTL活性。结果显示,pIR—optiGP5质粒免疫组在二免后可以检测到荧光抗体,而pIR—Ub—optiGP5质粒免疫组一直未检测到抗GP5抗体,但该免疫组的T淋巴细胞增殖指数及针对GP5的特异性CTL反应数值明显高于pIR—optiGP5质粒免疫组。这表明泛素与GP5的融合表达可增强细胞免疫反应。 相似文献
103.
PRRSV与PCV2体外共感染对猪肺泡巨噬细胞免疫学功能的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
制备猪肺泡巨噬细胞,分别接种PCV2、PRRSV、PCV2 PRRSV(先接种PCV2,12h后接种PRRSV)、PRRSV PCV2(先接种PRRSV,12h后接种PCV2)、PRRSV/PCV2(同时接种)和对照组。接种后不同时间观察细胞病变(CPE),并用real-time PCR和IFA方法检测PRRSV和PCV2滴度,INF-α、INF-γ、TNF-α、IL-8和IL-10的mRNA。结果为:①PRRSV能在PAM中增殖,有CPE;PCV2在PAM中感染率较低,无CPE。②PRRSV对PCV2增殖无明显影响。PCV2先于或同时与PRRSV感染对PRRSV的复制具有抑制作用,而PCV2后于PPRSV感染,可促进PRRSV增殖。③PCV2单独感染PAM后能促进INF-α、INF-γ、IL-8和IL-10的大量表达,对TNF-α的表达量影响不大。④PCV2与PRRSV混合感染,尤其是PCV2后于PRRSV感染后,TNF-α、IL-8和IL-10的表达量与单感染组相比明显增加,而INF-γ的表达量明显受到抑制。实验结果表明,PCV2感染时间对PRRSV的增殖影响不同,PRRSV感染后如果再感染PCV2,可以明显促进PRRSV病毒增殖;两种病毒共同刺激了TNF-α、IL-8和IL-10的大量表达,抑制了抗病毒因子INF-γ的表达,从而可能抑制体液免疫和细胞免疫,加重了病理学免疫应答。 相似文献
104.
板蓝根、黄芪对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外抑制作用 总被引:5,自引:0,他引:5
为了解中草药黄芪、板蓝根对病毒增殖的抑制作用,对黄芪、板蓝根及二者联合使用在Marc-145的单层细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的抑制作用进行了研究。结果表明,板蓝根能够显著抑制PRRSV体外增殖,对PRRSV的最小直接杀灭浓度为0.195 mg/mL,最小阻断浓度为0.097 mg/mL;黄芪对PRRSV增殖的抑制作用较弱。板蓝根、黄芪联合使用时对PRRSV的抑制作用显著增强,板蓝根对PRRSV的最小直接杀灭浓度降为0.097 mg/mL,最小阻断浓度降为0.049 mg/mL。 相似文献
105.
为构建猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)诊断DNA微阵列,应用RT—PCR从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)C14—2分离株和欧洲型弱毒疫苗株VP046扩增并克隆获得戋洲型重组质粒C14P9(基因号:AY775132)、PRRS—PS9(基因号:AY775134)、Ulb(基因号:AY775135)、Y11(基因号:AY775133)、Y12(基因号:AY775136)和欧洲型基因重组质粒E6和E8。PCR法制备的靶基因和探针纯化后,质量浓度分别为300~600mg/L和200-400mg/L。芯片杂交动力学研究表明,杂堑信号强度随靶基因和探针浓度的增加而增强,最佳靶基因质量浓度为200mg/L,探针适宜范围为3~3000μg/L,系统灵敏性为3μg/L。靶基因杂交特异性研究表明,除个别靶基因在某一温度下存在交叉反应和杂交信号弱外,大多数靶基因在40~56℃下杂交信号强。采用AY775133、AY775134、E6和E8靶基因构建PRRS诊断DNA微阵列在40℃下预杂交1h、48℃湿盒避光杂交6h后经洗涤和扫读分析,杂交信号强、斑点明显、特异性高,按SNR≥1.5为标准能够区分PRRSV蔓洲型和欧洲型。应用PRRS诊断DNA微阵列检测了AMERVAC-PRRS、PRRSV弱毒疫苗、C14—2株、SCU株和临床样本,能正确区分PRRSV基因型。研究结果表明构建的PRRS诊断DNA微阵列可用于PRRS临床诊断和基因分型。 相似文献
106.
猪瘟病毒猪细小病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒猪伪狂犬病病毒多重PCR方法的建立以及初步应用 总被引:9,自引:0,他引:9
猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪伪狂犬病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。本研究通过设计4对针对这4种病毒的特异引物建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:其敏感性可达到CSFV 10 TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50 CSFV 10TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50。同时具有较好的特异性,对猪瘟病毒石门株、猪瘟病毒兔化弱毒株、PRV闽南A株、PPV弱毒疫苗株、PRRSV KY 35株及PRRSV B13株6个毒株均能扩增出相应的片段,而BVDV、BDV均未扩增出相应的片段。本方法的建立对于这4种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。 相似文献
107.
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR/PCR扩增,分别扩增出大小为308 bp和417 bp的部分基因片段。用T4连接酶将目的片段与pGEM-Teasy载体系统连接,并转化到大肠杆菌DH-5α株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV和PCV2的阳性重组质粒。将重组标准质粒10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR),建立了PRRSV、PCV2的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为分析PRRSV和PCV2共感染猪体内病毒的绝对含量提供了必要的技术平台。 相似文献
108.
山东某些养殖场发生以母猪流产或产死胎、木乃伊等为特症的流行性繁殖障碍病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)所致.自行设计了一对针对PRRSV的N基因的特异性引物P1和P2,通过RT-PCR技术对分别从潍坊和济南收集到的可疑病料进行检测,结果为阳性,并得到1条366bp的DNA片段.纯化此扩增产物,然后与PMD-18T载体连接,转化大肠杆菌DH5α.结果得到了1个ORF7基因与PMD-18T载体的重组质粒PMD-18T-ORF7.通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR证明此重组质粒即为ORF7基因与PMD-18T载体的重组质粒,从而为ORF7基因及其表达的核衣壳蛋白进一步研究奠定了基础. 相似文献
109.
美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位基因表达及其产物的纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
对原核中以包涵体形式高效表达的美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位区段进行了变性、复性与纯化研究。将美洲型PRRSV重组质粒pGEX-6P-1-N转化入E.coliBL21(DE3)细胞中,成功表达了重组蛋白GST-N,超声裂解复性后目的蛋白经GSTrap FF纯化试剂盒纯化后,纯度可达90%以上。将欧洲型PRRSV重组质粒PQE30-N转化入E.coliM15细胞中表达了重组蛋白His-N。超声裂解后目的蛋白经HisTrapHP蛋白纯化试剂盒纯化后,纯度可达95%以上。Western blot结果表明,两种蛋白分别被美洲型和欧洲型PRRSV阳性血清识别。纯化出的大量美洲型与欧洲型PRRSV特异N蛋白抗原表位区段,为PRRSV的鉴别诊断提供了抗原基础。 相似文献
110.