尖孢镰刀菌甜瓜专化型基因组规模分泌蛋白的预测与分析

利用Signal P、Wo LF PSORT、TMHMM、big-PI Predictor、Target P和Secretome P等软件,对尖孢镰刀菌甜瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis,FOM)全基因组26 811条蛋白质氨基酸序列进行了分泌蛋白的预测分析。结果表明,FOM全基因组编码蛋白中有1 145个经典分泌蛋白,占编码蛋白总数的4.3%;有8 471个非经典分泌蛋白,占编码蛋白总数的31.6%。对经典分泌蛋白特征进行分析,发现其氨基酸长度集中在100~600个氨基酸,信号肽长度集中在17~22个氨基酸。对经典分泌蛋白的功能预测分析表明,有605个分泌蛋白获得了注释,主要涉及糖代谢、转运过程、过氧化氢代谢和生物合成等。对碳水化合物酶类(CAZymes)进行分析,结果表明有277个分泌蛋白为CAZymes,占经典分泌蛋白总数的24.2%。     

长双歧杆菌NCC2705分泌蛋白的全基因组预测和功能分析

以长双歧杆菌NCC2705基因组序列为研究对象,使用Signal P 4.0、Lipo P、TMHMM 2.0软件分析该基因组中的分泌蛋白及其信号肽的类型,同时采用COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)功能数据库对预测的分泌蛋白进行功能注释和聚类分析。结果表明,长双岐杆菌NCC2705中共有37个Sec途径分泌蛋白,其中Sec途径分泌蛋白包括27个被I型(SPaseⅠ)信号肽酶和10个Ⅱ型信号肽酶(Spase II)识别的蛋白,Sec途径分泌蛋白信号肽长度最多的有52个氨基酸,最少的有10个氨基酸。分泌蛋白的功能分析表明,该菌株分泌蛋白中含有大部分的假定蛋白,主要参与氨基酸代谢与转运、碳水化合物代谢转运,无机盐离子代谢转运,细胞壁和细胞膜生物合成的功能有关。     

大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基K63突变体表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

采用PCR方法从产肠毒素大肠杆菌(ETEC)44815菌株基因组中扩增不耐热肠毒素A亚基(LTA)编码基因,并将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因插入到含有人CD5信号肽序列的pcDNACD5sp真核表达载体中,构建成pcDNACD5sp/LTA分泌性真核表达载体,然后采用定点突变方法将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基第63位的丝氨酸改变为赖氨酸,构建成pcDNACD5sp/LTAK63突变体,经磷酸钙介导将pcDNACD5sp/LTAK63质粒转染HEK293T细胞进行表达.结果表明:试验克隆的大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因与GenBank中大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因序列相比,碱基序列、氨基酸序列同源性均达99%;表达产物经Western-blot检测,结果说明构建的含有人CD5信号肽的LTAK63基因能够在真核细胞中进行分泌性表达.     

可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1信号肽的鉴定及其酶活性分析

为明确可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1是否能够分泌至胞外及其活性,采用酵母互补试验分析了内切酶LtEg1的信号肽活性,利用3,5-二硝基水杨酸法检测了内切酶LtEg1活性,通过实时荧光定量PCR测定了LtEg1基因在不同侵染阶段的表达量。内切酶LtEg1的信号肽和酵母蔗糖酶的融合表达能够引起酵母蔗糖酶的外泌,使得酵母转化子能够在以棉子糖为唯一碳源的培养基上生长。内切酶LtEg1能够以羧甲基纤维素钠为底物,发挥其酶活功能。与营养菌丝阶段相比,LtEg1基因在病原菌侵染阶段的表达水平显著升高;且在接种后48 h,LtEg1基因的表达量达到高峰,约为营养菌丝阶段的12倍,表明内切酶LtEg1作为重要的外泌蛋白酶,在可可毛色二孢侵染致病过程发挥了重要作用。     

罗氏沼虾白斑综合症病毒WSSV ORF147片段的克隆、表达与序列分析

白斑综合症病毒WSSV(White Spot Syndrome Virus),是严重危害虾类养殖业的主要病原之一.本实验根据已知南美白对虾WSSV ORF147序列设计1对特异性引物,从患疑似白斑病毒病的罗氏沼虾中提取总DNA,用PCR法扩增得到1特异性片段.将该片段克隆进pET-28a( )载体,测序表明该片段全长1 475 bp,最大开放式阅读框为1 380 bp,编码459个氨基酸,预计其相对分子质量为51.9 kDa;与GenBank登录的WSSV ORF147序列(登录号AF369029)进行比对,核苷酸同源性为99%,证实为WSSV ORF147片段.将该片段在大肠杆菌E coli中进行表达,能获得相应的特异多肽条带.根据测序结果推导WSSV ORF147多肽在N端有信号肽序列,并且在氨基酸序列的122～144区间形成跨膜螺旋区.     

毕赤酵母(Pichia pastoris )分泌表达牛白细胞介素2

利用舍有强启动子PAOX1和α-因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZαA，构建出舍牛白细胞介素2(BoIL-2)基因的重组质粒BoIL2-pPICZαA。线性化的重组表达栽体转化到巴斯德毕赤酵母X-33及KM71H中，筛选Zeoein高抗性酵母菌株，甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blot检测表明，BoIL-2以融合蛋白形式在胞内表达，但没能分泌到胞外。通过BoIL-2在巴斯德毕赤酵母中的表达，重点讨论了信号肽、基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据已经发表的伪狂犬病病毒（PRV）Rice株的gE基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV闽A株糖蛋白gE基因除信号肽以外的全部编码区段,并克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌XL1-blue菌株,重组质粒pMD18-T-FL经酶切和PCR鉴定证实后,进行了序列测定。结果表明,重组质粒pMD18-T-FL含有PRV闽A株糖蛋白gE基因除信号除信号肽以外的全部编码区段,长1674bp。序列比较分析表明,此区段与PRV Rice株相应区段的核苷酸序列同源性为97．5％,氨基酸序列同源性为94．8％。     

抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核表达载体的构建

根据抗体重链与轻链基因的核苷酸序列设计并合成了1对引物,以猪外周血淋巴细胞基因组mRNA为模板,通过RT_PCR方法获得了一大小约85bp的DNA片段,并将其克隆到pGEM_T载体上进行序列测定,测序结果显示,猪抗体信号肽基因核苷酸序列长度为57bp,编码19个氨基酸,核苷酸及推导的氨基酸序列与已发表的抗体信号肽基因序列一致,同时在信号肽基因3’端下游提供可供肽酶切割的窗口和外源基因的克隆位点。然后将信号肽基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,成功构建了一含信号肽序列的真核表达载体3.1_SFc,为外源基因在pcDNA3.1( )中的表达与分泌提供了一有效的信号肽,也为研究基因的功能奠定了基础。     

应用计算机手段分析植物病原细菌Ralstonia solanacearum的蛋白质序列*

 应用SignalP 3.0，LipoP和TargetP对植物病原细菌Ralstonia solanacearum基因组中的3440个ORFs（open reading frames）进行了信号肽分析，同时系统分析了信号肽的类型及结构。结果表明，3440个ORFs中有462个ORFs所编码蛋白质具有N-端有信号肽序列，其中348个分泌类信号肽、100个信号肽具有RR-motif信号肽，14个脂蛋白类信号肽，未发现Prepilin-like 信号肽和Bacteriocin and Pheromone信号肽。在这462个具有可切割信号肽的分泌蛋白中，有84.0%蛋白质为胞外分泌型（S型），13.2%为线粒体分泌型（M型），另外有2.8%为其它类型的分泌蛋白。通过LipoP分析该菌的全基因组预测具有4种类型蛋白质，其中其中SpI有425个，占12.3%；SpII有80个，占2.3%；CYT有2541个，占73.9%；TMH有414个，占12.0%。比较了Ralstonia solanacearum和Pseudomonas syringae pv. tomato信号肽的长度及氨基酸的组成，发现这两种菌在这些方面存在这很大程度的相似性。本研究通过对Ralstonia solanacearum进行分泌蛋白和信号肽结构的分析，为将来功能基因组和分泌型外源蛋白的利用提供理论基础。     

鸭瘟病毒囊膜糖蛋白gH的原核表达和免疫印迹

根据鸭瘟病毒包膜糖蛋白H（gH）基因序列设计3对引物,PCR扩增的基因片段分别定向插入到原核表达载体pET28,构建了3种原核表达质粒pET-gH、pET-gH1347和pET-gH1707,并转化宿主菌BL21（DE3）。结果显示,去除了gH跨膜区和信号肽的gH基因片段（pET-gH1347和pET-gH1707）获得了表达,而全基因片段（pET-gH）未获得表达。Western-blot表明2种表达产物均能与鸭瘟病毒阳性血清发生特异性反应。鸭瘟病毒gH蛋白的成功表达,将有助于开展该基因功能的研究和血清学检测方法的建立。