新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多,却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子-GAP启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX,成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPHα。并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn2为报告基因进行功能验证,结果表明,该载体可实现xyn2基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU替换载体上原有的α-Factor信号肽,结果表明,INU信号肽能够有效引导XYNII的分泌。     

奶牛妊娠相关糖蛋白2的表达及结构功能预测分析

为了获得高效表达纯化并且抗原性较好的牛妊娠相关糖蛋白2（bovine pregnancy-associated glycoprotein 2，BoPAG2），对该蛋白的结构与功能进行生物信息学预测分析。通过PCR扩增荷斯坦奶牛BoPAG2基因，并将该基因连接至表达载体pET-28a，转化至大肠杆菌（BL21）中诱导表达并纯化，通过SDS-PAGE和Western blotting验证与检测该蛋白的大小和免疫学特性，通过生物信息学对BoPAG2蛋白的糖基化修饰、B细胞抗原表位、亲水性、信号肽，蛋白二级结构和3D模型、保守结构域以及蛋白互作进行预测分析。结果表明，本研究成功克隆出BoPAG2基因，通过诱导表达并纯化相应蛋白，通过SDS-PAGE和Western blotting验证BoPAG2蛋白的大小与预期结果相符，通过生物信息学预测分析结果显示，BoPAG2蛋白有5个位点发生糖基化修饰，分别为Asp⁵¹、Asp⁷¹、Asp¹¹⁴、Asp²⁵²和Asp³⁴³，该蛋白含有15个B细胞抗原表位，在N端含有15个氨基酸组成的信号肽序列，二级结构主要以无规则卷曲和延伸链为主，并且成功建立了BoPAG2蛋白的3D模型，该蛋白含有4个超家族结构域，蛋白互作分析结果显示，与BoPAG2互作的蛋白有7个，该蛋白可能参与了消化和吸收，以及母体在妊娠期的调节功能等过程。综上所述，本试验成功表达并纯化获得了BoPAG2蛋白。通过对BoPAG2蛋白的结构及功能进行生物信息学预测分析，为BoPAG2蛋白抗体的制备以及功能的研究提供了理论基础。     

鸡大肠杆菌(HJ20株)与人大肠杆菌(RHU845)P型菌毛同源性分析

运用Goldkey电脑软件对鸡源大肠杆菌与人源大肠杆菌P型菌毛蛋白结构基因序列、氨基酸序列、二级结构进行了比较分析,二者结构基因序列相似性82.5%.二者P型菌毛的信号肽序列基本相同,氨基酸序列相似性83.7%,并且菌毛蛋白在二级结构上存在较多的相似性.     

枯草芽孢杆菌AmyX基因信号肽性能优化研究

从枯草芽孢杆菌1A 747菌株基因组克隆Am yX基因信号肽序列,构建枯草芽孢杆菌分泌表达载体pYGAm yX,转化枯草杆菌W B 700得W B 700(pYGAm yX)。采用重叠PCR技术,将Am yX基因信号肽突变,使其N端正电荷增加,H区疏水性降低,利用突变后信号肽序列构建枯草杆菌分泌表达载体pYGMUT,转化枯草杆菌W B 700得W B 700(pYGMUT)。对W B 700(pYGAm yX)和W B 700(pYGMUT)的表达产物进行检测,研究Am yX基因信号肽突变对枯草杆菌蛋白分泌途径的影响。结果表明,W B 700(pYGAm yX)和W B 700(pYGMUT均能表达β-半乳糖苷酶,W B 700(pYGAm yX)的最高胞外酶活性达2 300 U,W B 700(pYGMUT)的最高酶活性达5 200 U。结果表明Am yX基因信号肽突变后构建的表达载体pYGMUT分泌表达β-半乳糖苷酶明显提高,说明β-半乳糖苷酶通过枯草杆菌T at途径分泌表达。     

辣椒疫霉中一个具有转录因子序列特征的外泌蛋白的分析鉴定

植物病原细菌分泌核调控蛋白进入寄主细胞核调控其基因表达以利于自身的侵染,但目前对卵菌中该类蛋白知之甚少.前期生物信息学分析从辣椒疫霉中获得一个具有DNA结合域的外泌蛋白PcSEP9,利用qRT-PCR检测其在辣椒疫霉侵染前期(菌丝、游动孢子囊、游动孢子、休止孢萌发)和侵染阶段[灌根接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)后1.5、3、6、12、24、36、72 h]的基因转录水平,发现该基因在辣椒疫霉的生长发育和侵染阶段均表达上调;对该基因进行TA克隆测序,对其编码的蛋白质进行结构域预测,发现其含有信号肽、核定位信号、DNA结合域和锌指RBZ结构域;将其信号肽的核苷酸编码序列克隆至酵母信号肽诱捕载体pSUC2T7M13ORI上,并转化到酵母蔗糖酶缺陷菌株YTK12中,发现重组菌株能成功分泌蔗糖酶,促使棉籽糖分解成单糖,且在YPRAA培养基上可正常生长,同时生成的单糖能与2,3,5-triphenyltetrazolium chloride反应产生红色不溶于水的氯化三苯基四氮唑,明确了该蛋白质的信号肽具有分泌活性;在本氏烟中进行瞬时表达,发现该蛋白质全长和成熟肽均能稳定表达,但对辣椒疫霉的毒力无明显影响.这一研究拓宽了对卵菌外泌蛋白质的认识,为进一步探索该类蛋白质的生物学功能及其作用机制提供了重要的试验数据.     

毕赤酵母高表达载体与高产β-甘露聚糖酶菌株的构建

本研究利用基因工程技术对pPIC9K载体进行改造,以提高β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达量,从而得到高产的β-甘露聚糖酶基因工程菌。     

人溶菌酶定点突变基因在毕赤酵母中的表达及活性分析

利用PCR法将人溶菌酶(h LYZ)成熟肽与载体信号肽连接处的氨基酸残基进行定点突变,突变基因亚克隆至酵母分泌型表达载体p PICZαA,重组载体线性化后通过电击转化法转化巴斯德毕赤酵母X-33,利用含Zeocine抗生素的YPDS平板筛选高拷贝转化子。转化子酵母经甲醇诱导后取培养基离心上清液进行SDS-PAGE和活性检测。结果显示,突变体h LYZ活力和表达量较野生型均有显著提高。表明定向改变h LYZ信号肽残基性质可以提高其表达量和分泌效率。     

含铁蛋白FAO1融合基因的衣藻核转化表达和分析

【目的】fao1编码Candida cloacae中一种含铁辅基的长链脂肪醇氧化酶。通过构建该基因的衣藻核转化表达载体进行转化,根据表达蛋白的生物活性判断fao1能否充分利用衣藻叶绿体中的铁元素行使功能;同时也为需铁固氮酶基因的研究提供方向。【方法】通过PCR把PsaD信号肽、fao1、His-tag标签融合,连接到pDBle载体上;采用玻璃珠转化法,将重组子导入莱茵衣藻（CW15）中;经博来霉素筛选后,获得转基因植株。运用PCR和RT-PCR法检测了转化衣藻,并且用亲和层析柱纯化蛋白,同时进行FAO1活性检测。【结果】重组质粒测序完全正确;PCR和RT-PCR检测转化衣藻基因组DNA和RNA,扩增片段与预期相符;转化衣藻FAO1蛋白纯化洗脱液使ABTS（2,2′-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐）底物反应变色。【结论】成功构建了信号肽、FAO1和His-tag融合基因的衣藻核转化表达载体,重组质粒已整合到莱茵衣藻基因组中,并成功转录,纯化的蛋白检测有活性。     

狂犬病病毒糖蛋白信号肽序列分析

为比较不同狂犬病病毒株糖蛋白信号肽序列的差异,测定了2株固定毒(CVS、3aG株)及2株街毒(Sx、PB3)的糖蛋白核苷酸序列,并推导了氨基酸序列.DNAstar软件分析表明:2株街毒糖蛋白信号肽同源性为100％,2株固定毒株同源性为84.2％,街毒株与CVS、3aG的同源性分别为78.9％和73.7％;2株街毒的信号肽序列与NCBI收录的我国近年来分离的街毒株的序列完全相同;街毒株与常用疫苗株间的同源性介于68.4％ ～ 84.2％,疫苗株PV与SRV9、PV与ERA、PV与SAG同源性均为100％.对糖蛋白信号肽疏水区(-15位到-4位)的二级结构预测和疏水值计算显示,街毒株信号肽的二级结构和疏水值均与常用疫苗株和固定株存在明显差异;在N2A细胞上效价测定显示,2株街毒的效价明显低于2株固定毒.     

介导分泌表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建

应用杆状病毒表达系统,将猪圆环病毒2型 ORF2 基因插入供体质粒pFastBac^TMDual pH启动子控制下的多克隆位点,引入EGT信号肽取代 ORF2 原有核定位信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以便于后期的纯化.将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体,提取重组Bacmid质粒.将阳性重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞,72 h收集培养上清液获得重组杆状病毒.间接免疫荧光试验和Western-blot表明,该重组杆状病毒可以在昆虫细胞实现猪圆环病毒2型Cap蛋白的分泌表达.